SARS-CoV-2 neutraliserende antistofdetektionssæt (ELISA)
【PRINCIP】
SARS-COV-2 neutraliserende antistofdetektionssæt er baseret på konkurrencedygtig ELISA-metode.
Brug af oprenset receptorbindende domæne (RBD), protein fra det virale spike (er) protein og værtscellen
Receptor ACE2, denne test er designet til at efterligne virus-vært-neutraliserende interaktion.
Kalibratorer, kvalitetskontrol og serum- eller plasmaprøver blandes individuelt godt i fortynding
Buffer indeholdende HACE2-HRP-konjugat alikvoteret i små rør. Så overføres blandingerne i
Mikropladningsbrøndene, der indeholder immobiliseret rekombinant SARS-cov-2 RBD-fragment (RBD) til
inkubation. I løbet af den 30 minutters inkubation, det RBD-specifikke antistof i kalibratorerne, QC og
Prøver konkurrerer med HACE2-HRP om specifik binding af RBD-immobiliseret i brøndene. Efter
Inkubationen, brøndene vaskes 4 gange for at fjerne ubundet HACE2-HRP-konjugat. En løsning af
TMB tilsættes derefter og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur, hvilket resulterer i udviklingen af en
blå farve. Farveudviklingen stoppes med tilføjelsen af 1N HCL, og absorbansen er
Målt spektrofotometrisk ved 450 nm. Intensiteten af den dannede farve er proportional med
Mængden af til stede enzym og er omvendt relateret til mængden af standarder, der er analyseret på samme måde.
Gennem sammenligning med kalibreringskurven dannet af de medfølgende kalibratorer, koncentrationen af
Neutraliserende antistoffer i den ukendte prøve beregnes derefter.
【Materialer krævet, men ikke leveret】
1. destilleret eller deioniseret vand
2. Præcisionspipetter: 10 μl, 100 μl, 200 μl og 1 ml
3. disponible pipette tip
4. mikropladerlæser, der er i stand til at læse absorbans ved 450nm.
5. Absorberende papir
6. Grafpapir
7. Vortex -mixer eller tilsvarende
【Prøveopsamling og opbevaring】
1. serum- og plasmaprøver opsamlet i rør, der indeholder K2-EDTA, kan bruges til dette sæt.
2. Prøver skal afdækkes og kan opbevares i op til 48 timer ved 2 ° C - 8 ° C inden analysen.
Prøver, der blev holdt i længere tid (op til 6 måneder), skal kun fryses en gang ved -20 ° C inden analysen.
Undgå gentagne frysetøningscyklusser.
Protokol
【Reagensforberedelse】
1. Alle reagenser skal tages ud af køling og får lov til at vende tilbage til stuetemperatur før brug
(20 ° til 25 ° C). Gem alle reagenser i køleskabet straks efter brug.
2. Alle prøver og kontroller skal hvirvle inden brug.
3. HACE2-HRP Opløsning Fremstilling: Fortynd HACE2-HRP Koncentrat ved 1: 51 fortyndingsforhold med fortynding
Buffer. Fortynd for eksempel 100 μl HACE2-HRP-koncentrat med 5,0 ml HRP-fortyndingsbuffer til
Lav en HACE2-HRP-løsning.
4. 1 × Vaskopløsning Fremstilling: Fortynd 20 × Vaskopløsningen med deioniseret eller destilleret vand med en
volumenforhold på 1:19. Fortynd for eksempel 20 ml 20 × WASH -opløsning med 380 ml deioniseret eller
Destilleret vand til at fremstille 400 ml 1 × vaskeopløsning.
【Testprocedure】
1. i separate rør, aliquot 120 μl af den forberedte HACE2-HRP-opløsning.
2. Tilsæt 6 μl kalibratorer, ukendte prøver, kvalitetskontrol i hvert rør og bland godt.
3. overfør 100 μl af hver blanding fremstillet i trin 2 til tilsvarende mikropladebrønde i henhold til
til forudindstillet testkonfiguration.
3. Dæk pladen med pladesætning og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
4. Fjern pladesætningen, og vask pladen med ca. 300 μl 1 × vaskeopløsning pr. Brønd i fire gange.
5. Tryk på pladen på papirhåndklæde for at fjerne resterende væske i brøndene efter vasketrin.
6. Tilsæt 100 μl TMB -opløsning til hver brønd og inkuber pladen i mørke ved 20 - 25 ° C i 20 minutter.
7. Tilsæt 50 μl stopopløsning til hver brønd for at stoppe reaktionen.
8. Læs absorbansen i mikropladelæser ved 450 nm inden for 10 minutter (630 nm som tilbehør er
anbefales til højere præcisionsydelse).