SARS-COV-2 neutraliseeriv antikehade tuvastamise komplekt (ELISA)
【Põhimõte】
SARS-COV-2 neutraliseeriv antikehade tuvastamise komplekt põhineb konkureerivatel ELISA metoodikal.
Kasutades puhastatud retseptori sidumisdomeeni (RBD), valk viiruse tera (S) valgust ja peremeesrakust
Retseptori ACE2, see test on mõeldud viiruse-peremehe neutraliseeriva interaktsiooni jäljendamiseks.
Kalibraatorid, kvaliteedikontrollid ning seerumi või plasmaproovid on lahjenduses eraldi segatud
Puhver, mis sisaldab väikestes torudes alikvoteeritud HACE2-HRP konjugaat. Siis kantakse segud sisse
Immobiliseeritud rekombinantset SARS-COV-2 RBD fragmenti (RBD) sisaldavad mikroplaadi kaevud
inkubatsioon. 30-minutise inkubatsiooni ajal RBD spetsiifiline antikeha kalibraatorites, QC-s ja
Proovid konkureerivad HACE2-HRP-ga süvendites immobiliseeritud RBD spetsiifilise seondumiseks. Pärast
Inkubatsioon, kaevud pestakse 4 korda, et eemaldada sidumata HACE2-HRP konjugaat. Lahendus
Seejärel lisatakse TMB ja inkubeeritakse 20 minutit toatemperatuuril, mille tulemuseks on a
sinine värv. Värvi areng peatatakse koos 1N HCl lisamisega ja neeldumine on
mõõdetud spektrofotomeetriliselt kiirusel 450 nm. Moodustatud värvi intensiivsus on võrdeline
Ensüümi kogus ja on pöördvõrdeliselt seotud samamoodi testitud standardite hulgaga.
Võrreldes kalibreerimiskõveraga, mille moodustasid kaasasolevad kalibraatorite, kontsentratsioon
Seejärel arvutatakse tundmatu proovi neutraliseerivad antikehad.
【Vajalikud materjalid, kuid neid ei pakuta】
1. destilleeritud või deioniseeritud vesi
2. täppispipetid: 10 μl, 100 μl, 200 μl ja 1 ml
3. Kasutatavad pipeti näpunäited
4. mikroplaadilugeja, kes on võimeline lugema neeldumist kiirusel 450 nm.
5. Imav paber
6. graafikpaber
7. Vortexi segisti või samaväärne
【Näidiste kogumine ja ladustamine】
1. K2-EDTA-d sisaldavatesse torudesse kogutud seerumi ja plasmaproove saab kasutada selle komplekti jaoks.
2. Proovid tuleks korkita ja neid võib enne analüüsimist temperatuuril 2 ° C - 8 ° C säilitada kuni 48 tundi.
Pikemat aega (kuni 6 kuud) hoitud isendeid tuleks külmutada ainult üks kord temperatuuril -20 ° C enne analüüsi.
Vältige korduvaid külmutamise-sulatatud tsüklit.
Protokoll
【Reagentide ettevalmistamine】
1. Kõik reaktiivid tuleb jahutusest välja võtta ja enne kasutamist lasta toatemperatuurile naasta
(20–25 ° C). Salvestage kõik külmkapis reagendid kohe pärast kasutamist.
2. Kõik proovid ja juhtnupud tuleks enne kasutamist keeristada.
3. HACE2-HRP lahuse ettevalmistamine: lahjendatud HACE2-HRP kontsentraat 1: 51 lahjendussuhtega lahjendusega
Puhver. Näiteks lahjendage 100 μl HACE2-HRP kontsentraati 5,0 ml HRP lahjenduspuhvriga
Tehke HACE2-HRP lahendus.
4. 1 x pesemislahuse ettevalmistamine: lahjendage 20 -kordne pesulahus deioniseeritud või destilleeritud veega a
mahu suhe 1:19. Näiteks lahjendage 20 ml 20 -kordset pesulahust 380 ml deioniseeritud või
destilleeritud vesi 400 ml 1 -kordse pesulahuse valmistamiseks.
【Katseprotseduur】
1. eraldi torudes alikvoot 120 μl valmistatud HACE2-HRP lahust.
2. Lisage igas torus 6 μl kalibraatoreid, tundmatuid proove, kvaliteedikontrollid ja segage hästi.
3. ülekandmine 2 -st segu, mis on ette valmistatud 2. etapis vastavatesse mikroplaadi süvenditesse vastavalt
Eelnevalt katsekonfiguratsioonile.
3. Katke plaat plaadi tihendiga ja inkubeerige temperatuuril 37 ° C 30 minutit.
4. Eemaldage plaadi tihendaja ja peske plaat umbes 300 μl 1x pesemislahusega neli korda.
5. Pärast sammude pesemist koputage paberrätikul olevasse vedeliku eemaldamiseks.
6. lisage igale süvendile 100 μl TMB lahust ja inkubeerige plaati pimedas temperatuuril 20–25 ° C 20 minutit.
7. Reaktsiooni peatamiseks lisage igale kaevule 50 μl stopplahust.
8
Soovitatav suurema täpsusega jõudluseks).