SARS-COV-2 neutraloiva vasta-aineiden havaitsemispakkaus (ELISA)
【PERIAATE】
SARS-COV-2 neutraloiva vasta-aineiden havaitsemispakkaus perustuu kilpailukykyiseen ELISA-menetelmään.
Käyttämällä puhdistettua reseptoria sitovaa domeenia (RBD), proteiini viruspihkiproteiinista ja isäntäsolusta
Reseptori ACE2, tämä testi on suunniteltu jäljittelemään virus-isäntä neutraloivaa vuorovaikutusta.
Kalibraattorit, laadunvalvonta ja seerumin tai plasmanäytteet sekoitetaan erikseen hyvin laimennukseen
puskuri, joka sisältää HACE2-HRP-konjugaattia, joka on alikvoottinen pienissä putkissa. Sitten seokset siirretään
Mikrolevykaivot, jotka sisältävät immobilisoitua rekombinantti SARS-COV-2 RBD -fragmenttia (RBD)
inkubointi. 30 minuutin inkubaation aikana RBD-spesifinen vasta-aine kalibraattoreissa, QC ja
Näytteet kilpailevat HACE2-HRP: n kanssa kaivoihin immobilisoidun RBD: n sitoutumisen spesifiseen sitomiseen. Jälkeen
Inkubaatio, kaivot pestään 4 kertaa sitoutumattoman HACE2-HRP-konjugaatin poistamiseksi. Liuos
TMB lisätään sitten ja inkuboida 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, mikä johtaa a
sininen väri. Värikehitys pysäytetään lisäämällä 1N HCl, ja absorbanssi on
mitattu spektrofotometrisesti 450 nm. Muodostuneen värin voimakkuus on verrannollinen
läsnä olevan entsyymin määrä, ja se liittyy käänteisesti samalla tavalla määritettyjen standardien määrään.
Vertailemalla toimitettujen kalibraattorien muodostama kalibrointikäyrä, pitoisuus
Sitten lasketaan tuntemattoman näytteen neutraloivat vasta -aineet.
【Vaaditaan materiaaleja, mutta ei toimitetu】
1. Tislattu tai deionisoitu vesi
2. Tarkkuuspipetit: 10 μl, 100 μl, 200 μl ja 1 ml
3. Kertakäyttöiset pipettivinkit
4.
5. imukykyinen paperi
6. Kaaviopaperi
7. Vortex -sekoitin tai vastaava
【Näytteen keräys ja tallennus】
K2-EDTA: ta sisältäviin putkiin kerättyjä seerumin ja plasmanäytteitä voidaan käyttää tähän pakkaukseen.
2. Näytteet tulisi rajoittaa ja ne voidaan säilyttää jopa 48 tuntia 2 ° C - 8 ° C ennen määritystä.
Näytteet pidempään (enintään 6 kuukautta) pidetään vain kerran kerran -20 ° C ennen määritystä.
Vältä toistuvia jäätymis- ja sulatusjaksoja.
Protokolla
【Reagenssin valmistelu】
1. Kaikki reagenssit on otettava pois jäähdytyksestä ja annettava palata huoneenlämpötilaan ennen käyttöä
(20 ° - 25 ° C). Tallenna kaikki jääkaapin reagenssit nopeasti käytön jälkeen.
2. Kaikki näytteet ja säätimet tulisi pyörtyä ennen käyttöä.
3. HACE2-HRP-liuoksen valmistus: Laimenna HACE2-HRP-konsentraatti 1: 51-laimennussuhteella laimennuksella
Puskuri. Esimerkiksi laimenna 100 μl HACE2-HRP-konsentraattia 5,0 ml: n HRP-laimennuspuskurilla
Tee HACE2-HRP-ratkaisu.
4. 1 x pesun liuoksen valmistus: Laimenna 20 -kertainen pesu liuos deionisoidulla tai tislatulla vedellä a
tilavuussuhde 1:19. Laimenna esimerkiksi 20 ml 20 x pesuluoosta 380 ml: lla deionisoitua tai
Tislattu vesi 400 ml: n 1 x pesuluoosta.
【Testimenetelmä】
1. Erillisissä putkissa, alikvootti 120 μl valmistettua HACE2-HRP-liuosta.
2. Lisää 6 μl kalibraattoreita, tuntemattomia näytteitä, laadunvalvontaa jokaisessa putkessa ja sekoita hyvin.
3. Siirrä 100 μl jokaisesta vaiheessa 2 valmistettua seosta vastaaviin mikrolevykaivoihin mukaan
ennalta suunniteltu testikokoonpano.
3. Peitä levy levytiivisteellä ja inkuboi 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan.
4. Irrota levyn tiiviste ja pese levy noin 300 μl: lla 1 x pesulaitosta kaivoa kohti neljä kertaa.
5. Napauta levyä paperipyyhkeessä, jotta voit poistaa jäännösnesteen kaivoista pesuvaiheiden jälkeen.
6. Lisää 100 μl TMB -liuosta jokaiseen kaivoon ja inkuboi levyä pimeässä 20 - 25 ° C: ssa 20 minuutin ajan.
7. Lisää 50 μl stop -liuosta jokaiseen kaivoon reaktion lopettamiseksi.
8. Lue mikrolevylukijan absorbanssi nopeudella 450 nm 10 minuutissa (630 nm, kuten lisävaruste on
Suositellaan tarkkuuden suorituskykyyn).