Kit de detección de anticorpos neutralizadores SARS-CoV-2 (ELISA)
【Principio】
O kit de detección de anticorpos neutralizadores SARS-CoV-2 está baseado na metodoloxía ELISA competitiva.
Usando dominio de unión ao receptor purificado (RBD), proteína da proteína (s) de espiga viral e da célula hóspede
O receptor ACE2, esta proba está deseñada para imitar a interacción neutralizante do virus.
Os calibradores, os controis de calidade e as mostras de soro ou plasma mestúranse individualmente ben en dilución
tampón que contén conxugado con HACE2-HRP aliquotado en pequenos tubos. Entón as mesturas transfírense en
Os pozos de microplacas que conteñen fragmento RBD SARS-CoV-2 inmobilizado (RBD) para
incubación. Durante a incubación de 30 minutos, o anticorpo específico de RBD nos calibradores, QC e
As mostras competirán co HACE2-HRP para a unión específica do RBD inmobilizado nos pozos. Despois
A incubación, os pozos son lavados 4 veces para eliminar conxugos HACE2-HRP non vinculados. Unha solución de
Engádese TMB e incubado durante 20 minutos a temperatura ambiente, dando lugar ao desenvolvemento dunha
cor azul. O desenvolvemento da cor está parado coa adición de 1N HCl, e a absorbancia é
medido espectrofotométricamente a 450 nm. A intensidade da cor formada é proporcional á
Cantidade de encima presente e está inversamente relacionada coa cantidade de normas analizadas do mesmo xeito.
Mediante comparación coa curva de calibración formada polos calibradores proporcionados, a concentración de
Calcúlase entón os anticorpos neutralizantes na mostra descoñecida.
【Materiais necesarios pero non proporcionados】
1. Auga destilada ou desionizada
2. Pipetas de precisión: 10 μL, 100 μL, 200 μL e 1 ml
3. Consellos de pipeta desbotables
4. Lector de microplacas capaz de ler a absorbancia a 450 nm.
5. Papel absorbente
6. Papel gráfico
7. Mixer de vórtice ou equivalente
【Recollida e almacenamento de exemplares】
1. As mostras de soro e plasma recollidas en tubos que conteñen K2-EDTA pódense usar para este kit.
2. Os exemplares deben ser cubertos e pódense almacenar ata 48 horas a 2 ° C - 8 ° C antes de analizar.
Os exemplares mantidos durante máis tempo (ata 6 meses) deben conxelarse só unha vez a -20 ° C antes do ensaio.
Evite os ciclos repetidos de conxelación-descongelación.
Protocolo
【Preparación do reactivo】
1. Todos os reactivos deben ser sacados da refrixeración e déixanse volver á temperatura ambiente antes do uso
(20 ° a 25 ° C). Garda todos os reactivos na neveira pronto despois do uso.
2. Todas as mostras e controis deben ser vortexadas antes do uso.
3. Preparación de solucións HACE2-HRP: Diluto Concentrado de HACE2-HRP a 1: 51 Relación de dilución coa dilución
Tampón. Por exemplo, diluír 100 µl de concentrado HACE2-HRP con 5,0 ml de tampón de dilución de HRP a
Fai unha solución HACE2-HRP.
4. 1 × Preparación da solución de lavado: diluír a solución de lavado 20 × con auga destilizada ou destilada cun
Relación de volume de 1:19. Por exemplo, diluír 20 ml de solución de lavado 20 × con 380 ml de desionizado ou
Auga destilada para facer 400 ml de solución de lavado 1 ×.
【Procedemento de proba】
1. En tubos separados, alícuota 120 μl da solución HACE2-HRP preparada.
2. Engade 6 µl de calibradores, mostras descoñecidas, controis de calidade en cada tubo e mestura ben.
3. Transfire 100 μl de cada mestura preparada no paso 2 en pozos de microplaca correspondentes segundo
a configuración de proba prediseñada.
3. Cubra a placa con selador de placas e incuba a 37 ° C durante 30 minutos.
4. Retire o selador de placas e lave a placa con aproximadamente 300 µl de solución de lavado 1 × por pozo por catro veces.
5. Toque a placa sobre toalla de papel para eliminar o líquido residual nos pozos despois do lavado.
6. Engade 100 µl de solución TMB a cada pozo e incuba a placa en escuridade a 20 - 25 ° C durante 20 minutos.
7. Engade 50 µl de solución de parada a cada pozo para deter a reacción.
8. Lea a absorbancia en Microplate Reader a 450 nm en 10 minutos (630 Nm como é accesorio
recomendado para un maior rendemento de precisión).