Kit de detección de anticorpos neutralizantes para o SARS-CoV-2 (ELISA) de Testsealabs
【PRINCIPIO】
O kit de detección de anticorpos neutralizantes para o SARS-CoV-2 baséase na metodoloxía ELISA competitiva.
Usando o dominio de unión ao receptor (RBD) purificado, a proteína da proteína da espícula viral (S) e a célula hóspede
receptor ACE2, esta proba está deseñada para imitar a interacción neutralizante virus-hóspede.
Os calibradores, os controis de calidade e as mostras de soro ou plasma mestúranse ben individualmente en dilución.
tampón que contén o conxugado hACE2-HRP alícuotado en tubos pequenos. Despois, as mesturas transfírense a
os pozos da microplaca que conteñen o fragmento RBD (RBD) recombinante do SARS-CoV-2 inmobilizado para
incubación. Durante a incubación de 30 minutos, o anticorpo específico de RBD nos calibradores, QC e
as mostras competirán coa hACE2-HRP pola unión específica ao RBD inmobilizado nos pozos. Despois
durante a incubación, os pozos lávanse 4 veces para eliminar o conxugado hACE2-HRP non unido. Unha solución de
A continuación, engádese TMB e incúbase durante 20 minutos a temperatura ambiente, o que resulta no desenvolvemento dun
cor azul. O desenvolvemento da cor detense coa adición de HCl 1N e a absorbancia é
medido espectrofotometricamente a 450 nm. A intensidade da cor formada é proporcional á
cantidade de encima presente e está inversamente relacionada coa cantidade de estándares ensaiados do mesmo xeito.
Mediante a comparación coa curva de calibración formada polos calibradores proporcionados, a concentración de
Calcúlanse entón os anticorpos neutralizantes na mostra descoñecida.


【MATERIAIS NECESARIOS PERO NON FORNECIDOS】
1. Auga destilada ou desionizada
2. Pipetas de precisión: 10 μL, 100 μL, 200 μL e 1 mL
3. Puntas de pipeta desbotables
4. Lector de microplacas capaz de ler a absorbancia a 450 nm.
5. Papel absorbente
6. Papel milimetrado
7. Mesturador vortex ou equivalente
【RECOLLIDA E ALMACENAMENTO DE MOSTRAS】
1. Para este kit pódense usar mostras de soro e plasma recollidas en tubos que conteñen K2-EDTA.
2. As mostras deben taparse e poden almacenarse ata 48 horas a 2 °C - 8 °C antes do ensaio.
As mostras conservadas durante un período prolongado (ata 6 meses) deben conxelarse só unha vez a -20 °C antes do ensaio.
Evitar ciclos repetidos de conxelación e desconxelación.
PROTOCOLO

【Preparación de reactivos】
1. Todos os reactivos deben retirarse da neveira e deixarse que volvan á temperatura ambiente antes do seu uso.
(20 °C a 25 °C). Garde todos os reactivos no frigorífico inmediatamente despois do seu uso.
2. Todas as mostras e os controis deben ser axitados en vórtex antes do seu uso.
3. Preparación da solución de hACE2-HRP: Diluír o concentrado de hACE2-HRP nunha proporción de dilución de 1:51 con Dilution
Tampón. Por exemplo, diluír 100 μL de concentrado de hACE2-HRP con 5,0 mL de tampón de dilución HRP para
preparar unha solución de hACE2-HRP.
4. Preparación da solución de lavado 1×: Diluír a solución de lavado 20× con auga desionizada ou destilada
proporción de volume de 1:19. Por exemplo, diluír 20 mL de solución de lavado 20× con 380 mL de auga desionizada ou
auga destilada para preparar 400 mL de solución de lavado 1×.
【Procedemento de proba】
1. En tubos separados, alícuote 120 μL da solución de hACE2-HRP preparada.
2. Engadir 6 μL de calibradores, mostras descoñecidas e controis de calidade en cada tubo e mesturar ben.
3. Transferir 100 μL de cada mestura preparada no paso 2 aos pozos correspondentes da microplaca segundo as instrucións
á configuración de proba prediseñada.
3. Cubrir a placa con selador de placas e incubar a 37 °C durante 30 minutos.
4. Retire o selador de placas e lave a placa con aproximadamente 300 μL de solución de lavado 1× por pozo catro veces.
5. Golpee a placa sobre unha toalla de papel para eliminar o líquido residual dos pozos despois dos pasos de lavado.
6. Engadir 100 μL de solución TMB a cada pozo e incubar a placa na escuridade a 20-25 °C durante 20 minutos.
7. Engadir 50 μL de solución de parada a cada pozo para deter a reacción.
8. Lea a absorbancia no lector de microplacas a 450 nm en 10 minutos (630 nm como accesorio)
recomendado para un rendemento de maior precisión).