SARS-COV-2 न्यूट्रलाइज़िंग एंटीबॉडी डिटेक्शन किट (एलिसा)
【सिद्धांत】
SARS-COV-2 न्यूट्रलाइज़िंग एंटीबॉडी डिटेक्शन किट प्रतिस्पर्धी एलिसा पद्धति पर आधारित है।
शुद्ध रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी), वायरल स्पाइक (एस) प्रोटीन और होस्ट सेल से प्रोटीन का उपयोग करना
रिसेप्टर ACE2, यह परीक्षण वायरस-होस्ट को बेअसर करने की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
कैलिब्रेटर, गुणवत्ता नियंत्रण, और सीरम या प्लाज्मा नमूनों को व्यक्तिगत रूप से कमजोर पड़ने में अच्छी तरह से मिलाया जाता है
छोटे ट्यूबों में HACE2-HRP संयुग्मित संयुग्म युक्त बफर। फिर मिश्रण को स्थानांतरित कर दिया जाता है
माइक्रोप्लेट कुओं में स्थिर पुनः संयोजक SARS-COV-2 RBD टुकड़ा (RBD) के लिए
ऊष्मायन। 30 मिनट के ऊष्मायन के दौरान, कैलिब्रेटर, क्यूसी और में आरबीडी विशिष्ट एंटीबॉडी
नमूने HACE2-HRP के साथ प्रतिस्पर्धा करेंगे, जो कि कुओं में स्थिर RBD को बाधित करते हैं। बाद
ऊष्मायन, कुओं को अनबाउंड HACE2-HRP संयुग्म को हटाने के लिए 4 बार धोया जाता है। का एक समाधान
टीएमबी को तब जोड़ा जाता है और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ऊष्मायन किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप ए का विकास होता है
नीला रंग। रंग विकास को 1 एन एचसीएल के अलावा बंद कर दिया जाता है, और अवशोषण है
450 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से मापा जाता है। गठित रंग की तीव्रता आनुपातिक है
मौजूद एंजाइम की मात्रा, और उसी तरह से परख किए गए मानकों की मात्रा से विपरीत रूप से संबंधित है।
प्रदान किए गए कैलिब्रेटर द्वारा गठित अंशांकन वक्र के साथ तुलना के माध्यम से, की एकाग्रता
अज्ञात नमूने में एंटीबॉडी को बेअसर करने की गणना की जाती है।
【सामग्री की आवश्यकता है लेकिन प्रदान नहीं किया गया】
1। आसुत या विआयनीकृत पानी
2। प्रिसिजन पिपेट: 10μL, 100μl, 200μl और 1 ml
3। डिस्पोजेबल पिपेट टिप्स
4। माइक्रोप्लेट रीडर 450nm पर अवशोषण पढ़ने में सक्षम है।
5। शोषक कागज
6। ग्राफ पेपर
7। भंवर मिक्सर या समकक्ष
【नमूना संग्रह और भंडारण】
1। K2-EDTA युक्त ट्यूबों में एकत्र किए गए सीरम और प्लाज्मा नमूनों का उपयोग इस किट के लिए किया जा सकता है।
2। नमूनों को कैप किया जाना चाहिए और परखने से पहले 2 डिग्री सेल्सियस - 8 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे तक संग्रहीत किया जा सकता है।
लंबे समय तक (6 महीने तक) के लिए आयोजित नमूने परख से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर केवल एक बार जमे हुए चाहिए।
बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्र से बचें।
शिष्टाचार
【अभिकर्मक तैयारी】
1। सभी अभिकर्मकों को प्रशीतन से बाहर निकाला जाना चाहिए और उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर लौटने की अनुमति दी जानी चाहिए
(20 ° से 25 ° C)। उपयोग के बाद तुरंत रेफ्रिजरेटर में सभी अभिकर्मकों को सहेजें।
2। सभी नमूनों और नियंत्रणों को उपयोग से पहले भंवर किया जाना चाहिए।
3। HACE2-HRP समाधान तैयारी: पतला HACE2-HRP को पतला करने के साथ 1: 51 कमजोर पड़ने के अनुपात में ध्यान केंद्रित करें
बफर। उदाहरण के लिए, HACE2-HRP के 100 μL को पतला करें। HRP कमजोर पड़ने वाले 5.0ml के साथ ध्यान केंद्रित करें
HACE2-HRP समाधान बनाएं।
4। 1 × वॉश सॉल्यूशन की तैयारी: 20 × वॉश सॉल्यूशन को विआयनीकृत या डिस्टिल्ड वॉटर के साथ एक के साथ पतला करें
1:19 का वॉल्यूम अनुपात। उदाहरण के लिए, 380 मिलीलीटर विआयनीकृत या के साथ 20 एमएल 20 × वॉश समाधान को पतला करें
1 × वॉश समाधान के 400 एमएल बनाने के लिए डिस्टिल्ड पानी।
【परीक्षण प्रक्रिया】
1। अलग-अलग ट्यूबों में, तैयार HACE2-HRP समाधान के 120μl को विभाजित करें।
2। 6 μl अंशशायक, अज्ञात नमूने, प्रत्येक ट्यूब में गुणवत्ता नियंत्रण जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
3। चरण 2 में तैयार किए गए प्रत्येक मिश्रण के 100μl को इसी माइक्रोप्लेट कुओं में स्थानांतरित करें
पूर्वनिर्धारित परीक्षण कॉन्फ़िगरेशन के लिए।
3। प्लेट को प्लेट सीलर के साथ कवर करें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
4। प्लेट सीलर निकालें और चार बार प्रति वेलफोर 1 × वॉश सॉल्यूशन के लगभग 300 μL के साथ प्लेट को धो लें।
5। धोने के बाद कुओं में अवशिष्ट तरल को हटाने के लिए कागज तौलिया पर प्लेट को टैप करें।
6। प्रत्येक कुएं में टीएमबी समाधान के 100 μl जोड़ें और 20 मिनट के लिए 20 - 25 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को अंधेरे में ऊष्मायन करें।
7। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं में 50 μL स्टॉप समाधान जोड़ें।
8। 10 मिनट के भीतर 450 एनएम पर माइक्रोप्लेट रीडर में अवशोषण पढ़ें (630nm गौण के रूप में है
उच्च परिशुद्धता प्रदर्शन के लिए अनुशंसित)।