SARS-COV-2 Neutralizirajući kit za otkrivanje antitijela (ELISA)
【NAČELO】
SARS-COV-2 neutralizirajući komplet za otkrivanje antitijela temelji se na konkurentnoj ELISA metodologiji.
Korištenje pročišćene domene za vezanje receptora (RBD), proteina iz proteina virusnih šiljaka i stanice domaćina
Receptor ACE2, ovaj je test osmišljen tako da oponaša interakciju neutralizirajuća virusa.
Kalibratori, kontrole kvalitete i uzorci seruma ili plazme dobro se miješaju u razrjeđivanju
Buffer koji sadrži konjugat HaCE2-HRP alikvotiran u malim cijevima. Tada se smjese prenose u
bušotine mikroploča koje sadrže imobilizirani rekombinantni SARS-COV-2 RBD fragment (RBD) za
inkubacija. Tijekom 30-minutne inkubacije, RBD specifično antitijelo u kalibratorima, QC i
Uzorci će se natjecati s HACE2-HRP za specifično vezanje RBD-a imobiliziranih u jažicama. Nakon
Inkubacija, jažice se ispire 4 puta kako bi se uklonili konjugat nevezanog HACE2-HRP. Rješenje
TMB se zatim dodaje i inkubira 20 minuta na sobnoj temperaturi, što rezultira razvojem a
Plava boja. Razvoj boje se zaustavlja dodavanjem 1n HCl -a, a apsorpcija je
izmjereno spektrofotometrijski na 450 nm. Intenzitet formirane boje proporcionalan je
Količina enzima prisutnog i obrnuto je povezana s količinom standarda ispitivanih na isti način.
Usporedbom s kalibracijskom krivuljom koju su formirali osigurani kalibratori, koncentracija
Zatim se izračunava neutralizacija antitijela u nepoznatom uzorku.
【Potrebni materijali, ali nisu navedeni】
1. Destilirana ili deionizirana voda
2. Precizne pipete: 10 μl, 100 μl, 200 μl i 1 ml
3. Savjeti za jednokratnu upotrebu
4. Čitatelj mikroploča sposoban za čitanje apsorpcije na 450 nm.
5. Upijajući papir
6. grafički papir
7. Vrtlog miksera ili ekvivalent
【Prikupljanje i skladištenje uzoraka】
1. Serum i uzorci plazme prikupljeni u cijevima koje sadrže K2-EDTA mogu se koristiti za ovaj komplet.
2. Uzorci trebaju biti ograničeni i mogu se pohraniti do 48 sati na 2 ° C - 8 ° C prije ispitivanja.
Uzorci koji se održavaju duže vrijeme (do 6 mjeseci) trebaju biti zamrznuti samo jednom na -20 ° C prije ispitivanja.
Izbjegavajte opetovane cikluse smrzavanja i odmrzavanja.
PROTOKOL
【Priprema reagensa】
1. Svi reagensi moraju se izvaditi iz hlađenja i ostaviti da se vrati na sobnu temperaturu prije upotrebe
(20 ° do 25 ° C). Spremite sve reagense u hladnjaku odmah nakon upotrebe.
2. Svi uzorci i kontrole trebaju biti vrtlog prije upotrebe.
3. Priprema otopine HaCE2-HRP: Razrijeđeni koncentrat HACE2-HRP u omjeru razrjeđivanja 1: 51 s razrjeđivanjem
Pufer. Na primjer, razrijedite 100 μl koncentrata HaCE2-HRP s 5,0 ml pufera za razrjeđivanje HRP-a do
Napravite rješenje HaCE2-HRP.
4. 1 × Priprema otopine za pranje: razrijedite otopinu za pranje od 20 × deioniziranom ili destiliranom vodom s a
Omjer volumena 1:19. Na primjer, razrijedite 20 ml otopine 20 × pranje s 380 ml deioniziranog ili
Destilirana voda za izradu 400 ml otopine 1 × pranje.
【Postupak ispitivanja】
1. U odvojenim cijevima, alikvot 120 μl pripremljene otopine HaCE2-HRP.
2. Dodajte 6 μl kalibratora, nepoznati uzorci, kontrole kvalitete u svakoj cijevi i dobro promiješajte.
3. Prijenos 100 μl svake smjese pripremljen u koraku 2 u odgovarajuće mikroploče u skladu
na unaprijed određenu konfiguraciju testa.
3. Pokrijte ploču pločicom za brtvljenje i inkubirajte na 37 ° C 30 minuta.
4. Uklonite brtvu ploče i oprate ploču s otprilike 300 μl otopine 1 × pranje po jažici za četiri puta.
5. Dodirnite ploču na papirnom ručniku da biste uklonili zaostalu tekućinu u bunarima nakon koraka pranja.
6. U svaku jažicu dodajte 100 μl otopine TMB i inkubirajte ploču u tami na 20 do 25 ° C 20 minuta.
7. Dodajte 50 μl Stop otopine u svaku bušotinu da biste zaustavili reakciju.
8. Pročitajte apsorbanciju u čitaču mikroploča na 450 nm u roku od 10 minuta (630nm kao dodatak je
Preporučuje se za veće performanse preciznosti).