ערכת גילוי נוגדנים מנטרלים SARS-COV-2 (ELISA)
【עִקָרוֹן】
ערכת גילוי הנוגדנים המנטרלים SARS-COV-2 מבוססת על מתודולוגיית ELISA תחרותית.
באמצעות תחום קשירת קולטנים מטוהרים (RBD), חלבון מהחלבון הנגיפי (ים) ותא המארח
קולטן ACE2, בדיקה זו נועדה לחקות את האינטראקציה המנטרלת מארח הנגיף.
כיול, בקרות איכות ודגימות סרום או פלזמה מעורבבים היטב בדילול
חיץ המכיל HACE2-HRP מצומד מחויב בצינורות קטנים. ואז התערובות מועברות ב
בארות המיקרו-פלייט המכילות שבר RBD רקומביננטי רקומביננטי (RBD) עבור
דְגִירָה. במהלך הדגירה של 30 דקות, הנוגדן הספציפי RBD בכיול, QC ו-
דוגמאות יתמודדו עם HACE2-HRP על כריכה ספציפית של ה- RBD המונע בבארות. לְאַחַר
הדגירה, הבארות נשטפות 4 פעמים כדי להסיר מצומדות HACE2-HRP בלתי מוגבלת. פיתרון של
לאחר מכן מוסיפים TMB ומודגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, וכתוצאה מכך התפתחות של א
צבע כחול. פיתוח הצבעים נעצר בתוספת 1n HCl, והספיגה היא
נמדד ספקטרופוטומטרית ב -450 ננומטר. עוצמת הצבע הנוצר היא פרופורציונאלית ל
כמות האנזים הקיימת, והיא קשורה הפוך לסכום התקנים שנבדקו באותה צורה.
באמצעות השוואה עם עקומת הכיול שנוצרה על ידי הכיול המסופק, הריכוז של
לאחר מכן מחושבים נוגדנים מנטרלים במדגם הלא ידוע.
【חומרים נדרשים אך לא מסופקים】
1. מים מזוקקים או מיובשים
2. פיפטות מדויקות: 10μl, 100μl, 200μl ו- 1 מ"ל
3. טיפים לפיפטה חד פעמית
4. קורא מיקרו -פלטים המסוגל לקרוא ספיגה במהירות של 450 ננומטר.
5. נייר סופג
6. נייר גרף
7. מיקסר מערבולת או שווה ערך
【איסוף ואחסון דגימות】
1. ניתן להשתמש בדגימות סרום ופלזמה שנאספו בצינורות המכילים K2-EDTA לערכה זו.
2. יש לכסות דגימות ויכולות להיות מאוחסנות עד 48 שעות ב 2 מעלות צלזיוס - 8 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.
יש להקפיא דגימות המוחזקות למשך זמן רב יותר (עד 6 חודשים) רק פעם אחת ב -20 מעלות צלזיוס לפני בדיקה.
הימנע מחזורי הפשרה הקפאה חוזרים ונשנים.
פּרוֹטוֹקוֹל
【הכנת מגיבים】
1. יש להוציא את כל הריאגנטים מהקירור ולהאפשר לחזור לטמפרטורת החדר לפני השימוש
(20 ° עד 25 מעלות צלזיוס). שמור את כל הריאגנטים במקרר מייד לאחר השימוש.
2. יש לנקוט את כל הדגימות והבקרות לפני השימוש.
3. HACE2-HRP הכנת תמיסה: תרכיז HACE2-HARP מדולל ביחס לדילול 1: 51 עם דילול
בַּלָם. לדוגמה, מדלל 100 μl של תרכיז HACE2-HRP עם 5.0 מ"ל של חיץ דילול HRP ל
ערוך פיתרון HACE2-HRP.
4. 1 × הכנת תמיסת שטיפה: דלל את תמיסת השטיפה 20 × עם מים מיונים או מזוקקים עם א
יחס נפח של 1:19. לדוגמה, מדללים 20 מ"ל של תמיסת שטיפה 20 × עם 380 מ"ל של מיון או
מים מזוקקים לייצור 400 מ"ל של תמיסת שטיפה של 1 ×.
【נוהל בדיקה】
1. בצינורות נפרדים, חלקו 120μl של תמיסת HACE2-HRP המוכנה.
2. הוסף 6 μL של כיולים, דגימות לא ידועות, בקרות איכות בכל צינור ומערבבים היטב.
3. העבירו 100 μl מכל תערובת שהוכנה בשלב 2 לבארות מיקרו -פלייט מתאימות על פי
לתצורת בדיקה מראש.
3. מכסים את הצלחת באוטם צלחת ודגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. הסר את אוטם הצלחת ושטוף את הצלחת בכ- 300 μl של תמיסת שטיפה 1 × לכל טוב ארבע פעמים.
5. הקש על הצלחת על מגבת הנייר כדי להסיר נוזל שיורי בבארות לאחר שטיפת מדרגות.
6. הוסף 100 μL של תמיסת TMB לכל באר ודגור את הצלחת בחושך ב 20 - 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
7. הוסף 50 μl של תמיסת עצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה.
8. קרא את הספיגה בקורא מיקרו -פלטה במהירות של 450 ננומטר תוך 10 דקות (630 ננומטר כאביזר הוא
מומלץ לביצועים מדויקים גבוהים יותר).