SARS-COV-2 neitralizējošs antivielu noteikšanas komplekts (ELISA)
【Princips】
SARS-COV-2 neitralizējošais antivielu noteikšanas komplekts ir balstīts uz konkurētspējīgu ELISA metodoloģiju.
Izmantojot attīrītu receptoru saistošo domēnu (RBD), olbaltumvielu no vīrusu smailes (-iem) olbaltumvielām un saimnieka šūnu
Receptor ACE2, šis tests ir paredzēts, lai imitētu vīrusa saimnieka neitralizējošo mijiedarbību.
Kalibratori, kvalitātes kontrole un seruma vai plazmas paraugi tiek labi sajaukti labi, atšķaidot labi
Buferis, kas satur HACE2-HRP, ir konjugēts, kas alikvēts mazās mēģenēs. Tad maisījumi tiek pārsūtīti
mikroplašu akas, kas satur imobilizētu rekombinanto SARS-COV-2 RBD fragmentu (RBD)
inkubācija. 30 minūšu inkubācijas laikā RBD specifiskā antiviela kalibratoros, QC un
Paraugi konkurēs ar HACE2-HRP par specifisku RBD saistīšanu, kas imobilizēta akās. Pēc
Inkubācija, akas 4 reizes mazgā, lai noņemtu nesaistīto HACE2-HRP konjugātu. Rašanās
Pēc tam TMB pievieno un inkubē 20 minūtes istabas temperatūrā, kā rezultātā attīstās a
zilā krāsa. Krāsu izstrāde tiek pārtraukta, pievienojot 1N HCl, un absorbcija ir
Izmērīts spektrofotometriski pie 450 nm. Izveidotās krāsas intensitāte ir proporcionāla
Fermenta daudzums, kas atrodas, un tas ir apgriezti saistīts ar tādā pašā veidā pārbaudīto standartu apjomam.
Salīdzinot ar kalibrēšanas līkni, ko veido nodrošinātie kalibratori, koncentrācija
Pēc tam aprēķina neitralizējošas antivielas nezināmā paraugā.
【Nepieciešami materiāli, bet nav paredzēti】
1. Destilēts vai dejonizēts ūdens
2. Precīzijas pipetes: 10 μl, 100 μl, 200 μl un 1 ml
3. Vienreizējās lietošanas pipetes padomi
4. Mikroplates lasītājs, kas spēj lasīt absorbciju pie 450 nm.
5. Absorbents papīrs
6. Grafika papīrs
7. Virpuļa maisītāja vai ekvivalents
【Paraugu kolekcija un glabāšana】
1. Seruma un plazmas paraugus, kas savākti caurulēs, kas satur K2-EDTA, var izmantot šim komplektam.
2. Paraugiem jābūt ierobežotiem, un tos var uzglabāt līdz 48 stundām 2 ° C - 8 ° C temperatūrā pirms pārbaudes.
Paraugiem, kas tiek turēti ilgāku laiku (līdz 6 mēnešiem), pirms testa ir jāsasaldē tikai vienu reizi -20 ° C.
Izvairieties no atkārtotiem iesaldēšanas un atkausēšanas cikliem.
Protokols
【Reaģenta sagatavošana】
1. Visi reaģenti ir jāizņem no saldēšanas un ļauj pirms lietošanas atgriezties istabas temperatūrā
(20 ° līdz 25 ° C). Pēc lietošanas ātri saglabājiet visus reaģentus ledusskapī.
2. Visi paraugi un vadības ierīces pirms lietošanas jāapmeklē.
3. HACE2-HRP šķīduma sagatavošana: atšķaidīta HACE2-HRP koncentrāts pie 1: 51 atšķaidīšanas attiecība ar atšķaidīšanu
Buferis. Piemēram, atšķaidīts 100 μL HACE2-HRP koncentrāts ar 5,0 ml HRP atšķaidīšanas bufera līdz
Izveidojiet HACE2-HRP risinājumu.
4. 1 × mazgāšanas šķīduma preparāts: atšķaidiet 20 × mazgāšanas šķīdumu ar dejonizētu vai destilētu ūdeni ar a
Tilpuma attiecība 1:19. Piemēram, atšķaidīts 20 ml 20 × mazgāšanas šķīduma ar 380 ml dejonizēta vai
destilēts ūdens, lai izgatavotu 400 ml 1 × mazgāšanas šķīduma.
【Testa procedūra】
1. Atsevišķās mēģenēs alikvots 120 μl sagatavotā HACE2-HRP šķīduma.
2. Pievienojiet 6 μl kalibratoru, nezināmus paraugus, kvalitātes kontroli katrā mēģenē un labi samaisiet.
3. Pārnesiet 100 μl katra maisījuma, kas sagatavots 2. solī
uz iepriekš parakstītu testa konfigurāciju.
3 30 minūtes pārklājiet plāksni ar plāksnes blīvētāju un inkubē 37 ° C temperatūrā.
4. Noņemiet plāksnes blīvējumu un nomazgājiet plāksni ar aptuveni 300 μl 1 × mazgāšanas šķīduma četras reizes.
5. Pieskarieties plāksnei uz papīra dvieļa, lai pēc mazgāšanas pakāpieniem noņemtu šķidrumu atlikušo šķidrumu.
6. Pievienojiet katrai iedobei 100 μl TMB šķīduma un 20 minūtes inkubējiet plāksni tumšā krāsā 20–25 ° C temperatūrā.
7. Pievienojiet katrai akai 50 μl apturēšanas šķīduma, lai apturētu reakciju.
8. Izlasiet absorbciju mikroplate lasītājā pie 450 nm 10 minūšu laikā (630 nm kā piederums ir
ieteicams augstākai precizitātes veiktspējai).