SARS-COV-2 Komplet za otkrivanje antitela (ELISA)
【Princip】
Sars-Cov-2 komplet za otkrivanje antitela zasnovan je na konkurentnoj metodologiji ELISA.
Korištenje pročišćenog domena vezivanja receptora (RBD), proteina iz proteina virusnog šiljaka i ćelije domaćina
Receptor ACE2, ovaj test dizajniran je za oponašanje interakcije neutralizacije virusa.
Kalibratori, kontrole kvalitete i uzorke seruma ili plazme pojedinačno se miješaju dobro u razrjeđivanju
Buffer koji sadrži ALIQUEED u mačkama u malim cijevima. Tada se mješavine prenose u
Mikroplatni bunari koji sadrže imobilizirani rekombinantni SARS-Cov-2 fragment RBD (RBD) za
Inkubacija. Tokom 30-minutne inkubacije, specifična antitijela RBD u kalibratorima, QC i
Uzorci će se nadmetati sa HACE2-HRP-om za specifično vezivanje RBD imobilisanog u bunarima. Poslije
Inkubacija, bunari se ispiraju 4 puta kako bi uklonili nevezani HACE2-HRP konjugat. Rešenje
TMB se zatim dodaje i inkubira 20 minuta na sobnoj temperaturi, što rezultira razvojem a
Plava boja. Razvoj u boji zaustavlja se dodavanjem 1n HCl, a apsorbancija je
Izmjereno spektrofotometrijski na 450 Nm. Intenzitet formirane boje proporcionalan je
Količina enzima prisutna i obrnuto se odnosi na iznos standarda koji su na isti način testirani.
Kroz usporedbu sa kalibracijskom krivuljom koju su formirali pruženi kalibratori, koncentracija
Zatim se izračunava neutralizacija antitijela u nepoznatom uzorku.
【Potrebni materijali, ali nisu pruženi】
1. Destilirana ili deionizirana voda
2. Precizni pipeti: 10μl, 100 μl, 200 μl i 1 ml
3. Savjeti za jednokratnu pipetu
4. Čitač mikroploča koji može čitati apsorbanciju na 450nm.
5. Apsorbiran papir
6. Grafički papir
7. Vortex mikser ili ekvivalent
【Prikupljanje i skladištenje uzoraka】
1. Uzorci seruma i plazme prikupljeni u cijevima koji sadrže K2-EDTA mogu se koristiti za ovaj komplet.
2. Uzorci trebaju biti ograničeni i mogu se pohraniti do 48 sati na 2 ° C - 8 ° C prije nego što testi.
Uzorci se održavaju duže vrijeme (do 6 mjeseci) trebaju se zamrznuti samo jednom na -20 ° C prije tegljača.
Izbjegavajte ponovljene cikluse smrzavanja.
Protokol
【Priprema reagensa】
1. Svi reagensi moraju biti izvučeni iz hlađenja i dopušteno da se vrate na sobnu temperaturu prije upotrebe
(20 ° do 25 ° C). Spremite sve reagense u hladnjaku odmah nakon upotrebe.
2. Svi uzorci i kontrole treba vrtjeti prije upotrebe.
3. Rješenje HACE2-HRP: Razblažite omjer razrjeđivanja od 1: 51 razrjeđivanje s razrjeđivanjem
Buffer. Na primjer, razblažite 100 μl HACE2-HRP koncentrata sa 5,0ml HRP pufer razrjeđivanja na
Napravite rešenje HACE2-HRP.
4. 1 × Rešenje rješenja: Razblažite 20 × rješenje za pranje s deioniziranim ili destiliranim vodom sa a
Omjer zapremine 1:19. Na primjer, razblažite 20 ml 20 × rješenje za pranje sa 380 ml deionizirane ili
Destilirana voda za izradu 400 ml 1 × rješenje za pranje.
【Postupak ispitivanja】
1. U zasebnim cijevima, aliquot 120μl pripremljene rešenje HACE2-HRP.
2. Dodajte 6 μL kalibratora, nepoznatih uzoraka, kontrole kvalitete u svakoj cijevi i dobro miješajte.
3. Prijenos 100 μl svake smjese pripremljena u koraku 2 u odgovarajuće mikrovatne bušotine prema
na predesignutu konfiguraciju testa.
3. Pokrijte ploču sa pločama i inkubirajte na 37 ° C 30 minuta.
4. Izvadite ploče za brtvljenje i oprati ploču sa približno 300 μl 1 × rješenje za pranje po četiri puta.
5 Dodirnite ploču na papirnom ručniku da biste uklonili preostalu tečnost u bunarima nakon koraka pranja.
6. Dodajte 100 μl TMB rješenja za svaki bunar i inkubirajte ploču u tami u 20 - 25 ° C 20 minuta.
7. Dodajte 50 μl rješenja za zaustavljanje za zaustavljanje reakcije.
8. Pročitajte apsorbanci u mikroplate čitaču pri 450 Nm u krugu od 10 minuta (630nm kao dodatak je
Preporučuje se za veće precizne performanse).