SARS-COV-2 antigorputz hautemateko kit neutralizatzea (Elisa)
E 【OinarriE】
SARS-COV-2 antigorputz hautemateko kit neutralizazioa Elisa metodologia lehiakorrean oinarritzen da.
Hartzaile araztua lotzeko domeinua (RBD) erabiliz, proteina erpin biriko (k) proteina eta ostalari zelulatik
Hartzailearen Ace2, proba hau birusaren ostalariaren elkarrekintza neutralizatzeko imitatzeko diseinatuta dago.
Kalibratzaileek, kalitate kontrolak eta serumak edo plasma laginak banan-banan nahasten dira diluzioan
HACE2-HRP konjugatua duen bufferra hodi txikietan. Ondoren nahasketak transferitzen dira
SARS-COV-2 RBD zatiketa (RBD) birkonbinatzaile immobilizatua duten mikroplato putzuak
Inkubazioa. 30 minutuko inkubazioan, CALIBrators, QC eta
Laginak Hace2-HRP-rekin lehiatuko dira putzuetan immobilizatutako RBD lotesleak lortzeko. -Ren ondoren
Inkubazioa, putzuak 4 aldiz garbitzen dira LocBound Hace2-HRP konjugatua kentzeko. Konponbide bat
Ondoren, TMB gehitu eta 20 minutuz inkubatu da, giro-tenperaturan, a
kolore urdina. Koloreen garapena 1n hcl gehitzearekin gelditzen da, eta xurgapena da
espektrofotometrikoki neurtuta 450 nm-tan. Eratutako kolorearen intentsitatea proportzionala da
Entzima zenbatekoa presente dago, eta modu alderantziz lotuta dago modu berean probatu diren estandarren kopuruarekin.
Kalibratzaileek emandako kalibratzaileek, kontzentrazioa sortutako kalibrazio kurbaarekin alderatuta
Lagin ezezagunean antigorputz neutralizatzea kalkulatzen da.
E 【Behar diren materialak baina ez dira ematenE】
1. Ur destilatua edo desionizatua
2. Zehaztasun pipetak: 10μl, 100μL, 200μL eta 1 ml
3. botatzeko pipeta aholkuak
4. Microplate irakurlea 450NM-ko xurgapena egiteko gai da.
5. Paper xurgatzailea
6. Paper grafikoa
7. Vortex nahastailea edo baliokidea
E 【Aleen bilketa eta biltegiaE】
1. K2-EDTA duten hodietan bildutako hodietan bildutako laginak serum eta plasma laginak erabil daitezke kit honetarako.
2. Aleak kateatu behar dira eta gehienez 48 orduz gorde daitezke 2 ºC-tan - 8 ºC-ra.
Denbora luzeagoan (6 hilabete arte gehienez) egindako aleak -20 ºC-tan bakarrik izoztu beharko lirateke.
Saihestu izozte izozte zikloak errepikatu.
Protokolo
E 【Erreaktibo prestaketaE】
1. erreaktibo guztiak hozteetatik atera behar dira eta erabili aurretik tenperaturara itzultzeko baimena eman behar da
(20 ° eta 25 ºC). Gorde erreaktibo guztiak hozkailuan berehala erabili ondoren.
2. Lagin eta kontrol guztiak aldatu egin beharko lirateke erabili aurretik.
3. HACE2-HRP irtenbide prestaketa: Diluta Hace2-HRP kontzentratua 1: 51 diluzio-erlazioarekin diluzioarekin
Buffer. Adibidez, diluitu 100 μL HACE2-HRP kontzentratua HRP diluzio bufferrarekin 5,0 ml-rekin
Egin HACE2-HRP irtenbidea.
4. 1 × Garbitu irtenbide prestaketa: diluitu 20 × garbitzeko soluzioa ur desionizatu edo destilatuarekin
1:19 bolumen erlazioa. Adibidez, diluitu 20 × 20 ml 20 ml deionizatutako 380 ml-rekin edo
Ur destilatua 400 ml 1 × garbitzeko soluzioa egiteko.
E 【Probako prozeduraE】
1. Hodi bereizietan, ALQUOT 120μL prestatutako HACE2-HRP soluzioan.
2. Gehitu 6 μl kalibratzaile, lagin ezezagunak, kalitate kontrolak hodi bakoitzean eta ondo nahastu.
3. Transferitu 100μL-k 2. urratsean prestatutako nahasketa bakoitzaren arabera
proba konfigurazioa aurrez idatzita.
3. Estali platera plaka zigilatzailearekin eta inkubatu 37 ºC-tan 30 minutuz.
4. Kendu plaka zigilatzailea eta garbitu plaka gutxi gorabehera 300 μL-ko 1 μ x 5 aldiz.
5. Punteatu platera paperezko eskuoihalean, putzuetan hondar likidoa kentzeko putzuetan.
6. Gehitu 100 μL-ko TMB irtenbide bakoitza ondo eta inkubatu platera iluntzean 20 - 25 ° C-tan 20 minutuz.
7. Gehitu 50 μl geldialdiaren irtenbide bakoitzari erreakzioa gelditzeko.
8. Irakurri xurgapena MicroPlate Reader-en 450 nm-tan 10 minuturen buruan (630NM osagarria da
gomendagarria zehaztasun handiagoko errendimendua lortzeko).