SARS-COV-2 neutralizuojantis antikūnų aptikimo rinkinys (ELISA)
【Principas】
SARS-COV-2 neutralizuojantis antikūnų aptikimo rinkinys yra pagrįstas konkurencine ELISA metodika.
Naudojant išgrynintą receptorių surišimo domeną (RBD), baltymus iš viruso smaigalio (-ų) baltymo ir šeimininko ląstelės
Receptorių ACE2, šis testas yra skirtas imituoti virusų šeimininko neutralizuojančią sąveiką.
Kalibratoriai, kokybės kontrolė ir serumo ar plazmos mėginiai yra atskirai sumaišomi skiedžiant
Buferis, kuriame yra HACE2-HRP, konjuguoti mažuose vamzdeliuose. Tada mišiniai perkeliami
Mikroplato šuliniai, kuriuose yra imobilizuotas rekombinantinis SARS-COV-2 RBD fragmentas (RBD), skirtas skirti
inkubacija. 30 minučių inkubacijos metu RBD specifinis antikūnas kalibratoriuose, qc ir
Mėginiai konkuruos su HACE2-HRP dėl specifinio surišimo RBD, imobilizuoto šuliniuose. Po
Inkubacija, šuliniai plaunami 4 kartus, kad būtų pašalintas nesurištas HACE2-HRP konjugatas. Sprendimas
Tada pridedama TMB ir inkubuojama 20 minučių kambario temperatūroje, todėl sukuriama a
mėlyna spalva. Spalvų vystymasis sustabdomas pridedant 1n HCl, o absorbcija yra
Išmatuotas spektrofotometriškai esant 450 nm. Suformuotos spalvos intensyvumas yra proporcingas
Esamas fermento kiekis ir yra atvirkščiai susijęs su tuo pačiu būdu tiriamų standartų kiekiu.
Palyginus su kalibravimo kreive, kurią sudarė pateikti kalibratoriai, koncentracija
Tada apskaičiuojami neutralizuojantys antikūnai nežinomame mėginyje.
【Reikalingos medžiagos, bet nepateiktos】
1. Distiliuotas arba dejonizuotas vanduo
2. Tiksliosios pipetės: 10 μl, 100 μl, 200 μl ir 1 ml
3. Vienkartiniai pipetės galiukai
4. Mikroplato skaitytuvas, galintis skaityti absorbciją 450 nm.
5. Absorbuojamas popierius
6. GRAFTO POPERTAS
7. „Vortex“ maišytuvas arba lygiavertis
【Pavyzdžių kolekcija ir saugojimas】
1. Serumo ir plazmos mėginiai, surinkti vamzdeliuose, kuriuose yra K2-EDTA, gali būti naudojami šiam rinkiniui.
2. Pavyzdžiai turėtų būti uždengti ir prieš tyrimą gali būti laikomi iki 48 valandų 2 ° C - 8 ° C temperatūroje.
Ilgesnį laiką (iki 6 mėnesių) laikomi pavyzdžiai turėtų būti užšaldyti tik vieną kartą –20 ° C temperatūroje prieš tyrimą.
Venkite pakartotinių užšalimo-atšildymo ciklų.
Protokolas
【Reagento paruošimas】
1. Visi reagentai turi būti išvežti iš šaldymo ir leisti grįžti į kambario temperatūrą prieš naudojimą
(Nuo 20 ° iki 25 ° C). Išsaugokite visus šaldytuvų reagentus nedelsdami po naudojimo.
2. Visi mėginiai ir valdikliai prieš naudojimą turėtų būti sūkuriuojami.
3. HACE2-HRP tirpalo paruošimas: Praskieskite HACE2-HRP koncentratą 1: 51 skiedimo santykis su praskiedimu
Buferis. Pavyzdžiui, praskieskite 100 μl HACE2-HRP koncentrato su 5,0 ml HRP skiedimo buferio iki
Padarykite HACE2-HRP sprendimą.
4. 1 × plovimo tirpalo paruošimas: praskieskite 20x plovimo tirpalą dejonizuotu arba distiliuotu vandeniu a
tūrio santykis 1:19. Pavyzdžiui, praskieskite 20 ml 20 x plovimo tirpalo su 380 ml dejonizuoto arba
Distiliuotas vanduo, kad gautų 400 ml 1 × plovimo tirpalo.
【Bandymo procedūra】
1. Atskirose vamzdeliuose 120 μl paruošto HACE2-HRP tirpalo alikvotinė dalis.
2. Įpilkite 6 μl kalibratorių, nežinomus mėginius, kokybės kontrolę kiekviename vamzdyje ir gerai išmaišykite.
3. Perkelkite 100 μl kiekvieno mišinio, paruošto 2 žingsnyje
į iš anksto sukurtą bandymo konfigūraciją.
3. Uždenkite plokštelę plokštelės sandarikliu ir inkubuokite 37 ° C temperatūroje 30 minučių.
4. Nuimkite plokštelės sandariklį ir plaukite plokštę maždaug 300 μl 1 x plovimo tirpalo viename šulinyje keturis kartus.
5. Bakstelėkite plokštelę ant popierinio rankšluosčio, kad po skalbimo žingsnių pašalintumėte likusį skystį šuliniuose.
6. Į kiekvieną šulinį įpilkite 100 μl TMB tirpalo ir 20 minučių inkubuokite plokštelę tamsoje 20–25 ° C temperatūroje.
7. Kiekvienam šuliniui įpilkite 50 μl STOP tirpalo, kad sustabdytumėte reakciją.
8. Perskaitykite „Microplate Reader“ sugertį 450 nm per 10 minučių (630 nm, koks yra priedas
Rekomenduojama aukštesniam tikslumo veikimui).