Kit ta 'Sejbien ta' Antikorpi Neutralizzanti SARS-Cov-2 (ELISA)
【Prinċipju】
Il-kit ta 'skoperta ta' antikorpi newtralizzanti tas-SARS-CoV-2 huwa bbażat fuq metodoloġija ELISA kompetittiva.
Bl-użu ta 'dominju li jorbot riċettur purifikat (RBD), proteina mill-proteina (i) virali u ċ-ċellula ospitanti
Ir-riċettur ACE2, dan it-test huwa ddisinjat biex jimita l-interazzjoni newtralizzanti tal-virus.
Kalibraturi, kontrolli tal-kwalità, u kampjuni tas-serum jew tal-plażma huma mħallta individwalment sew f'dilwizzjoni
Buffer li fih HACE2-HRP konjugat alikwotat f'tubi żgħar. Imbagħad it-taħlitiet jiġu trasferiti ġewwa
Il-bjar tal-microplate li fihom framment rikombinanti immobilizzat SARS-CoV-2 RBD (RBD) għal
inkubazzjoni. Matul l-inkubazzjoni ta '30 minuta, l-antikorp speċifiku RBD fil-kalibraturi, QC u
Il-kampjuni se jikkompetu mal-HACE2-HRP biex jorbtu speċifiku l-RBD immobilizzat fil-bjar. Wara
L-inkubazzjoni, il-bjar jinħaslu 4 darbiet biex jitneħħew konjugat HACE2-HRP mhux marbut. Soluzzjoni ta '
TMB imbagħad jiġi miżjud u inkubat għal 20 minuta f'temperatura tal-kamra, li jirriżulta fl-iżvilupp ta '
kulur blu. L-iżvilupp tal-kulur jitwaqqaf biż-żieda ta '1n hcl, u l-assorbenza hija
imkejjel spettrofotometrikament f'450 nm. L - intensità tal-kulur iffurmat hija proporzjonali għall -
Ammont ta 'enzima preżenti, u huwa relatat b'mod invers mal-ammont ta' standards evalwati bl-istess mod.
Permezz ta 'paragun mal - kurva ta' kalibrazzjoni ffurmata mill-kalibraturi pprovduti, il - konċentrazzjoni ta '
L-antikorpi li jinnewtralizzaw fil-kampjun mhux magħruf huwa mbagħad ikkalkulat.
【Materjali meħtieġa iżda mhux ipprovduti】
1. Ilma distillat jew dejonizzat
2. Pipetti ta 'preċiżjoni: 10μl, 100μl, 200μL u 1 ml
3. Għajnuniet tal-pipetta li jintremew
4. Qarrej tal-microplate kapaċi jaqra assorbenza f'450nm.
5. Karta assorbenti
6. Karta tal-graff
7. Vortex Mixer jew ekwivalenti
【Ġbir u ħażna tal-kampjuni】
1. Kampjuni fis-serum u fil-plażma miġbura f'tubi li fihom K2-EDTA jistgħu jintużaw għal dan il-kit.
2. Kampjuni għandhom jiġu limitati u jistgħu jinħażnu sa 48 siegħa f'temperatura ta '2 ° C - 8 ° C qabel l-assaġġ.
Il-kampjuni miżmuma għal żmien itwal (sa 6 xhur) għandhom ikunu ffriżati darba biss f'temperatura ta '-20 ° C qabel l-assaġġ.
Evita ċikli ripetuti tal-iffriżar.
Protokoll
【Preparazzjoni tar-reaġent】
1. Ir-reaġenti kollha għandhom jinħarġu mir-refriġerazzjoni u jitħallew jirritornaw għat-temperatura tal-kamra qabel l-użu
(20 ° sa 25 ° C). Issejvja r-reaġenti kollha fil-friġġ fil-pront wara l-użu.
2. Il-kampjuni u l-kontrolli kollha għandhom ikunu vortiċi qabel l-użu.
3
Buffer. Pereżempju, iddilwixxi 100 μl ta 'konċentrat ta' HACE2-HRP b'5,0ml ta 'buffer ta' dilwizzjoni HRP għal
Agħmel soluzzjoni HACE2-HRP.
4. Preparazzjoni tas-Soluzzjoni tal-Aħsel 1
Proporzjon tal-volum ta '1:19. Pereżempju, iddilwixxi 20 ml ta '20 × soluzzjoni tal-ħasil b'380 ml ta' dejonizzata jew
Ilma distillat biex tagħmel 400 ml ta '1 × soluzzjoni tal-ħasil.
【Proċedura tat-test】
1. F'tubi separati, alikwot ta '120μl tas-soluzzjoni ppreparata ta' HACE2-HRP.
2. Żid 6 μl ta 'kalibraturi, kampjuni mhux magħrufa, kontrolli ta' kwalità f'kull tubu u ħawwad sewwa.
3
Biex tikkonferma l-konfigurazzjoni tat-test.
3. Għatti l-pjanċa bis-siġillatur tal-pjanċa u inkuba f'37 ° C għal 30 minuta.
4
5. Tektek il-pjanċa fuq xugaman tal-karta biex tneħħi likwidu residwu fil-bjar wara l-passi tal-ħasil.
6. Żid 100 μl ta 'soluzzjoni TMB għal kull bir u inkuba l-pjanċa fid-dlam f'20 - 25 ° C għal 20 minuta.
7. Żid 50 μl ta 'soluzzjoni ta' waqfien ma 'kull bir biex twaqqaf ir-reazzjoni.
8. Aqra l-assorbenza fil-qarrej tal-microplate f'450 nm fi żmien 10 minuti (630nm bħala aċċessorju
Rakkomandat għal prestazzjoni ta 'preċiżjoni ogħla).