Набор для обнаружения антител SARS-COV-2 (ELISA)
【ПРИНЦИП】
Набор для определения нейтрализующих антител SARS-COV-2 основан на конкурентной методологии ELISA.
Используя очищенный домен связывания рецептора (RBD), белок из белка вирусного шипа (S) и клетки -хозяина
Рецептор ACE2, этот тест предназначен для имитации взаимодействия нейтрализующих вирус-хост.
Калибраторы, контроль качества и образцы сыворотки или плазмы индивидуально смешаны в разведении
Буфер, содержащий конъюгат HACE2-HRP, аликвотирован в небольших трубках. Тогда смеси переносятся в
Микропланированные скважины, содержащие иммобилизованный рекомбинантный фрагмент RBD SARS-COV-2 (RBD) для
инкубация. Во время 30-минутной инкубации, RBD-специфическое антитело в калибраторах, QC и
Образцы будут конкурировать с HACE2-HRP за специфическое связывание RBD, иммобилизованного в лунках. После
Инкубация, скважины промывают 4 раза для удаления несвязанного конъюгата HACE2-HRP. Решение
Затем добавляют TMB и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре, что приводит к разработке
синий цвет. Развитие цвета останавливается с добавлением 1n HCl, а поглощение
измерено спектрофотометрически при 450 нм. Интенсивность образованного цвета пропорциональна
количество присутствующего фермента и обратно связано с количеством стандартов, проведенных таким же образом.
По сравнению с калибровочной кривой, образованной предоставленными калибраторами, концентрация
Затем рассчитывается нейтрализующие антитела в неизвестном образце.
【Материалы требуются, но не предоставлены】
1. дистиллированная или деионизированная вода
2. Precision Pipettes: 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл и 1 мл
3. Одноразовые советы по пипетке
4. Читатель микропланшетов, способный к чтению поглощения при 450 нм.
5. абсорбирующая бумага
6. Графическая бумага
7. вихревой микшер или эквивалент
【Сбор и хранение образцов】
1. Сыворотки и образцы плазмы, собранные в трубках, содержащих K2-EDTA, могут использоваться для этого комплекта.
2. Образцы должны быть ограничены и могут храниться в течение 48 часов при 2 ° C - 8 ° C перед анализом.
Образцы, удерживаемые в течение более длительного времени (до 6 месяцев), должны быть заморожены только один раз при -20 ° C до анализа.
Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.
Протокол
【Подготовка реагентов】
1. Все реагенты должны быть выведены из охлаждения и позволять вернуться к комнатной температуре перед использованием
(От 20 ° до 25 ° C). Сохраните все реагенты в холодильнике быстро после использования.
2. Все образцы и элементы управления должны быть встряхиты перед использованием.
3. Приготовление раствора HACE2-HRP: разбавить концентрат HACE2-HRP при соотношении разбавления 1: 51 с разведением
Буфер. Например, разбавление 100 мкл концентрата HACE2-HRP с 5,0 мл буфера для разбавления HRP до
Сделайте решение HACE2-HRP.
4. 1 × препарат раствора для промывки: разбавьте раствор для промывания 20 -кратного промывания деионизированной или дистиллированной водой
Отношение объема 1:19. Например, разбавить 20 мл раствора 20 × промывочного раствора 380 мл деионизированного или
дистиллированная вода, чтобы сделать 400 мл 1 × раствор для мытья.
【Процедура тестирования】
1. В отдельных трубках аликвота 120 мкл приготовленного раствора HACE2-HRP.
2. Добавьте 6 мкл калибраторов, неизвестные образцы, контроль качества в каждой трубке и хорошо перемешайте.
3. Перенесите 100 мкл каждой смеси, приготовленной на стадии 2 в соответствующие микроплансорованные скважины в соответствии с
к предварительно разработанной тестовой конфигурации.
3. Покройте пластину герметиком и инкубируйте при 37 ° C в течение 30 минут.
4. Снимите герметик пластины и промойте пластину приблизительно 300 мкл 1 × раствор для промывки на Wellor For of For a.
5. Коснитесь на пластину на бумажном полотенце, чтобы удалить остаточную жидкость в лунках после шагов.
6. Добавьте 100 мкл раствора TMB в каждую лунку и инкубируйте пластину в темноте при 20-25 ° C в течение 20 минут.
7. Добавьте 50 мкл стоп -раствора в каждую лунку, чтобы остановить реакцию.
8. Прочитайте поглощение в считывателе микропланшетов при 450 нм в течение 10 минут (630 нм, как аксессуар
Рекомендуется для более высокой точной производительности).