ชุดตรวจจับแอนติบอดี SARS-COV-2 (ELISA)
-หลักการ-
ชุดตรวจจับแอนติบอดี SARS-COV-2 เป็นกลางขึ้นอยู่กับวิธีการแข่งขัน ELISA
การใช้โดเมนการจับตัวรับบริสุทธิ์ (RBD) โปรตีนจากโปรตีนสไปค์ไวรัสและเซลล์โฮสต์
ตัวรับ ACE2 การทดสอบนี้ออกแบบมาเพื่อเลียนแบบการปฏิสัมพันธ์ระหว่างไวรัสโฮสต์
เครื่องสอบเทียบการควบคุมคุณภาพและตัวอย่างซีรั่มหรือพลาสมามีการผสมกันอย่างดีเป็นรายบุคคลในการเจือจาง
บัฟเฟอร์ที่มี HACE2-HRP คอนจูเกตลงนามในหลอดขนาดเล็ก จากนั้นส่วนผสมจะถูกถ่ายโอนใน
หลุมไมโครเพลทที่มีชิ้นส่วน recombinant SARS-COV-2 RBD (RBD)
การฟักตัว ในระหว่างการบ่ม 30 นาทีแอนติบอดีเฉพาะ RBD ในเครื่องสอบเทียบ QC และ
ตัวอย่างจะแข่งขันกับ HACE2-HRP สำหรับการเชื่อมโยงเฉพาะ RBD ที่ถูกตรึงในหลุม หลังจาก
การฟักตัวบ่อจะถูกล้าง 4 ครั้งเพื่อลบคอนจูเกต HACE2-HRP ที่ไม่ได้ผูกไว้ ทางออกของ
TMB จะถูกเพิ่มและบ่มเป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้องส่งผลให้เกิดการพัฒนาของ A
สีฟ้า การพัฒนาสีจะหยุดด้วยการเพิ่ม 1n HCl และการดูดกลืนแสงคือ
วัดสเปกโตรโฟโตเมติกที่ 450 นาโนเมตร ความเข้มของสีที่เกิดขึ้นนั้นเป็นสัดส่วนกับ
จำนวนของเอนไซม์ที่มีอยู่และมีความสัมพันธ์แบบผกผันกับจำนวนมาตรฐานที่ตรวจสอบในลักษณะเดียวกัน
ผ่านการเปรียบเทียบกับเส้นโค้งการสอบเทียบที่เกิดจากการสอบเทียบที่ให้ไว้ความเข้มข้นของ
จากนั้นคำนวณแอนติบอดีที่เป็นกลางในตัวอย่างที่ไม่รู้จัก
-วัสดุที่จำเป็น แต่ไม่ได้จัดเตรียมไว้-
1. น้ำกลั่นหรือปราศจากไอออน
2. ปิเปตที่แม่นยำ: 10μl, 100μl, 200μlและ 1 mL
3. เคล็ดลับปิเปตแบบใช้แล้วทิ้ง
4. เครื่องอ่านไมโครเพลทที่สามารถอ่านการดูดกลืนแสงได้ที่ 450Nm
5. กระดาษดูดซับ
6. กระดาษกราฟ
7. Vortex Mixer หรือเทียบเท่า
-การเก็บรวบรวมและจัดเก็บตัวอย่าง-
1. ตัวอย่างซีรั่มและพลาสมาที่รวบรวมในหลอดที่มี K2-EDTA สามารถใช้สำหรับชุดนี้ได้
2. ตัวอย่างควรต่อยอดและอาจถูกเก็บไว้นานถึง 48 ชั่วโมงที่ 2 ° C - 8 ° C ก่อนการทดสอบ
ตัวอย่างที่จัดขึ้นเป็นเวลานาน (สูงสุด 6 เดือน) ควรถูกแช่แข็งเพียงครั้งเดียวที่ -20 ° C ก่อนการทดสอบ
หลีกเลี่ยงรอบการแช่แข็งซ้ำ ๆ
โปรโตคอล
-การเตรียมน้ำยา-
1. รีเอเจนต์ทั้งหมดจะต้องนำออกจากเครื่องทำความเย็นและได้รับอนุญาตให้กลับไปที่อุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน
(20 °ถึง 25 ° C) บันทึกรีเอเจนต์ทั้งหมดในตู้เย็นทันทีหลังการใช้งาน
2. ตัวอย่างและการควบคุมทั้งหมดควรเป็นกระแสน้ำวนก่อนการใช้งาน
3. การเตรียมสารละลาย HACE2-HRP: เจือจาง HACE2-HRP เข้มข้นที่อัตราส่วนการเจือจาง 1: 51 ด้วยการเจือจาง
บัฟเฟอร์ ตัวอย่างเช่นเจือจาง 100 μlของ HACE2-HRP เข้มข้นด้วยบัฟเฟอร์การเจือจาง HRP 5.0ml เป็น
ทำโซลูชัน HACE2-HRP
4. การเตรียมสารละลาย 1 ×ล้าง: เจือจางสารละลาย 20 ×ล้างด้วยน้ำปราศจากไอออนหรือกลั่นด้วย
อัตราส่วนปริมาตร 1:19 ตัวอย่างเช่นเจือจาง 20 มล. ของสารละลาย 20 ×ล้างด้วย 380 มล. ของ deionized หรือ
น้ำกลั่นเพื่อทำสารละลาย 1 ×ล้าง 400 มล.
-ขั้นตอนการทดสอบ-
1. ในหลอดที่แยกต่างหาก, aliquot 120μlของสารละลาย HACE2-HRP ที่เตรียมไว้
2. เพิ่มการสอบเทียบ 6 μl, ตัวอย่างที่ไม่รู้จัก, การควบคุมคุณภาพในแต่ละหลอดและผสมให้เข้ากัน
3. ถ่ายโอน100μlของแต่ละส่วนผสมที่เตรียมไว้ในขั้นตอนที่ 2 ไปยังหลุมไมโครเพลทที่สอดคล้องกันตาม
เพื่อกำหนดค่าการทดสอบล่วงหน้า
3. คลุมแผ่นด้วยแผ่นปิดผนึกแผ่นและฟักตัวที่ 37 ° C เป็นเวลา 30 นาที
4. ถอดเครื่องซีลแผ่นและล้างจานด้วยสารละลาย 1 ×ล้างประมาณ 300 ไมโครลิตรต่อสี่ครั้ง
5. แตะจานบนกระดาษเช็ดมือเพื่อเอาของเหลวที่เหลืออยู่ในหลุมหลังจากล้างขั้นตอน
6. เพิ่มสารละลาย TMB 100 μlให้กับแต่ละหลุมและบ่มจานในที่มืดที่ 20 - 25 ° C เป็นเวลา 20 นาที
7. เพิ่มโซลูชันหยุด 50 ไมโครลิตรให้กับแต่ละหลุมเพื่อหยุดปฏิกิริยา
8. อ่านการดูดกลืนแสงในเครื่องอ่านไมโครเพลทที่ 450 นาโนเมตรภายใน 10 นาที (630nm เป็นอุปกรณ์เสริมคือ
แนะนำสำหรับประสิทธิภาพที่แม่นยำสูงกว่า)