SARS-COV-2 nötralize edici antikor tespit kiti (ELISA)
【İlke】
SARS-COV-2 nötralize edici antikor tespit kiti rekabetçi ELISA metodolojisine dayanmaktadır.
Saflaştırılmış reseptör bağlanma alanı (RBD), viral sivri (S) proteinden ve konakçı hücreden protein kullanılarak
Reseptör ACE2, Bu test virüs-barındırıcı nötralize edici etkileşimi taklit etmek için tasarlanmıştır.
Kalibratörler, kalite kontrolleri ve serum veya plazma örnekleri, seyreltmede ayrı ayrı karıştırılır
Küçük tüplerde HACE2-HRP konjugatını içeren tampon. Sonra karışımlar aktarılır
Hareketsizleştirilmiş rekombinant SARS-COV-2 RBD fragmanı (RBD) içeren mikroplaka kuyuları
kuluçka. 30 dakikalık inkübasyon sırasında, kalibratörler, QC ve
Numuneler, oyuklarda hareketsizleştirilen RBD'nin spesifik bağlanması için HACE2-HRP ile rekabet edecektir. Sonrasında
İnkübasyon, kuyucuklar, bağlanmamış HACE2-HRP konjugatını uzaklaştırmak için 4 kez yıkanır. Bir çözümü
TMB daha sonra eklenir ve oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe edilir, bu da bir
mavi renk. Renk gelişimi 1N HC1 ilavesiyle durdurulur ve absorbans
450 nm'de spektrofotometrik olarak ölçüldü. Oluşturulan rengin yoğunluğu,
mevcut enzim miktarı ve aynı şekilde tahlil edilen standartların miktarı ile ters ilişkilidir.
Sağlanan kalibratörler tarafından oluşturulan kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırıldığında, konsantrasyonu
Bilinmeyen numunedeki nötralize edici antikorlar daha sonra hesaplanır.
【Gerekli ancak sağlanmayan malzemeler】
1. damıtılmış veya deiyonize su
2. Hassas pipetler: 10μl, 100μl, 200μl ve 1 ml
3. Tek kullanımlık pipet uçları
4. 450nm'de absorbans okuyabilen mikroplaka okuyucu.
5. Emici kağıt
6. Grafik kağıdı
7. Vorteks mikseri veya eşdeğeri
【Örnek toplama ve depolama】
1. K2-EDTA içeren tüplerde toplanan serum ve plazma örnekleri bu kit için kullanılabilir.
2. Örnekler sınırlandırılmalı ve tahlilden önce 2 ° C - 8 ° C'de 48 saate kadar saklanabilir.
Daha uzun süre tutulan örnekler (6 aya kadar) testten önce -20 ° C'de sadece bir kez dondurulmalıdır.
Tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının.
Protokol
【Reaktif Hazırlık】
1. Tüm reaktifler soğutmadan çıkarılmalı ve kullanımdan önce oda sıcaklığına dönmelerine izin verilmelidir.
(20 ° ila 25 ° C). Tüm reaktifleri kullandıktan hemen sonra buzdolabında kaydedin.
2. Tüm numuneler ve kontroller kullanılmadan önce girdaplanmalıdır.
3. HACE2-HRP Çözelti Hazırlama: Seyreltme ile 1: 51 seyreltme oranında seyreltik HACE2-HRP konsantresini seyreltin
Tampon. Örneğin, 100 uL HACE2-HRP konsantresini 5.0ml HRP seyreltme tamponu ile seyreltin
HACE2-HRP çözümü yapın.
4. 1 × Yıkama Çözeltisi Hazırlık: 20 × yıkama çözeltisini, deiyonize veya damıtılmış su ile seyreltin Bir
1:19 hacim oranı. Örneğin, 380 ml deiyonize olan 20 ml 20 × yıkama çözeltisini seyreltin veya
400 ml 1 x yıkama çözeltisi yapmak için damıtılmış su.
【Test prosedürü】
1. Ayrı tüplerde, hazırlanan HACE2-HRP çözeltisinin 120μl'si.
2. 6 μL kalibratör, bilinmeyen numuneler, her tüpe kalite kontrolleri ekleyin ve iyice karıştırın.
3. Adım 2'de hazırlanan her karışımın 100μl'si karşılık gelen mikroplak kuyularına aktarın
önceden tasarlanmış test yapılandırması için.
3. Plakayı plaka sızdırmazlığı ile örtün ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Plaka sızdırmazlığı çıkarın ve plakayı dört kez kuyu başına yaklaşık 300 μl 1 × yıkama çözeltisi ile yıkayın.
5. Yıkamadan sonra kuyularındaki artık sıvıyı çıkarmak için kağıt havluya plakaya dokunun.
6. Her oyuğa 100 uL TMB çözeltisi ekleyin ve plakayı 20 - 25 ° C'de 20 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin.
7. Reaksiyonu durdurmak için her oyuğa 50 uL durdurma çözeltisi ekleyin.
8. Mikroplaka okuyucudaki absorbansı 10 dakika içinde 450 nm'de okuyun (aksesuar olduğu için 630nm
daha yüksek hassasiyet performans için önerilir).