مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة SARS-COV-2 (ELISA)
【مبدأ】
تعتمد مجموعة الكشف عن الأجسام المضادة SARS-COV-2 على منهجية ELISA التنافسية.
باستخدام مجال ربط المستقبلات المنقى (RBD) ، والبروتين من بروتين الارتفاع الفيروسي (S) والخلية المضيفة
مستقبلات ACE2 ، تم تصميم هذا الاختبار لتقليد التفاعل بين الفيروس المضيف.
يتم خلط محركات المعايرة وعناصر التحكم في الجودة وعينات المصل أو البلازما بشكل فردي في التخفيف
المخزن المؤقت الذي يحتوي على HACE2-HRP مترافق في أنابيب صغيرة. ثم يتم نقل المخاليط في
آبار الألواح الدقيقة التي تحتوي على شظية SARS-2 RBD المؤتلف المؤتلف (RBD)
حضانة. خلال الحضانة التي مدتها 30 دقيقة ، فإن الأجسام المضادة المحددة RBD في المعايير ، مراقبة الجودة و
سوف تتنافس العينات مع HACE2-HRP لربط محدد RBD يجمد في الآبار. بعد
الحضانة ، يتم غسل الآبار 4 مرات لإزالة مفترسة HACE2-HRP غير مزامنة. حل
ثم تتم إضافة TMB وتحضيرها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مما يؤدي إلى تطوير أ
اللون الأزرق. يتم إيقاف تطوير الألوان مع إضافة 1N HCl ، والامتصاص هو
قياس الطيف في 450 نانومتر. شدة اللون المتكون تتناسب مع
مقدار الإنزيم الموجود ، ويرتبط عكسيا بمقدار المعايير التي تم تقييمها بنفس الطريقة.
من خلال المقارنة مع منحنى المعايرة الذي يتكون من المعايير المقدمة ، فإن تركيز
ثم يتم حساب تحييد الأجسام المضادة في العينة غير المعروفة.
【المواد المطلوبة ولكن لم يتم توفيرها】
1. مقطرة أو ماء منزوع الأيونات
2. ماصات الدقة: 10 ميكرولتر ، 100 ميكرولتر ، 200 ميكرولتر و 1 مل
3. نصائح ماصة يمكن التخلص منها
4. قارئ Microplate قادر على قراءة الامتصاص في 450 نانومتر.
5. ورقة ماصة
6. ورقة الرسم البياني
7. خلاط دوامة أو ما يعادلها
【جمع العينات وتخزينها】
1. يمكن استخدام عينات المصل والبلازما التي تم جمعها في أنابيب تحتوي على K2-EDTA لهذه المجموعة.
2. يجب أن يتم تغطية العينات وقد يتم تخزينها لمدة تصل إلى 48 ساعة عند 2 درجة مئوية - 8 درجة مئوية قبل التقييم.
يجب تجميد العينات التي تم عقدها لفترة أطول (حتى 6 أشهر) مرة واحدة فقط عند -20 درجة مئوية قبل الفحص.
تجنب دورات الجليد المتكررة.
بروتوكول
【تحضير الكاشف】
1. يجب إخراج جميع الكواشف من التبريد والسماح لها بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام
(20 درجة إلى 25 درجة مئوية). احفظ جميع الكواشف في الثلاجة على الفور بعد الاستخدام.
2. يجب أن تكون جميع العينات وعناصر التحكم دوامة قبل الاستخدام.
3. تحضير محلول HACE2-HRP: تهدئة HACE2-HRP عند نسبة التخفيف 1: 51 مع التخفيف
المخزن المؤقت. على سبيل المثال ، تخفيف 100 ميكرولتر من تركيز HACE2-HRP مع 5.0 مل من المخزن المؤقت لتخفيف HRP إلى
جعل حل HACE2-HRP.
4. 1 × تحضير محلول الغسيل: قم بتخفيف محلول 20 × غسل بالماء منزوع الأيونات أو المقطر مع أ
نسبة الحجم من 1:19. على سبيل المثال ، تخفيف 20 مل من محلول غسل 20 × مع 380 مل من منزوع الأيونات أو
الماء المقطر لجعل 400 مل من محلول غسل 1 ×.
【إجراء الاختبار】
1. في أنابيب منفصلة ، قسامة 120μL من محلول HACE2-HRP المحضر.
2. أضف 6 ميكرولتر من المعايير ، وعينات غير معروفة ، وعناصر التحكم في الجودة في كل أنبوب وتخلط جيدا.
3. نقل 100 ميكرولتر من كل خليط تم تحضيره في الخطوة 2 إلى آبار الألواح الدقيقة المقابلة
لتكوين اختبار مسبقة.
3. قم بتغطية اللوحة مع سدادات اللوحة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. قم بإزالة سدادات اللوحة وغسل اللوحة بحوالي 300 ميكرولتر من محلول الغسيل 1 × لكل بئر أربع مرات.
5. اضغط على اللوحة على منشفة ورقية لإزالة السائل المتبقي في الآبار بعد خطوات الغسيل.
6. أضف 100 ميكرولتر من محلول TMB لكل بئر واحتضان اللوحة في الظلام عند 20 - 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
7. أضف 50 ميكرولتر من محلول إيقاف لكل بئر لإيقاف رد الفعل.
8. اقرأ الامتصاص في قارئ الألواح الدقيقة في 450 نانومتر في غضون 10 دقائق (630 نانومتر كملحق
موصى به لأداء دقة أعلى).