Kit di rilevamento degli anticorpi neutralizzanti SARS-COV-2 (ELISA)
【PRINCIPIO】
Il kit di rilevamento degli anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 si basa sulla metodologia ELISA competitiva.
Utilizzando il dominio di legame del recettore purificato (RBD), la proteina dalla proteina virale (S) e la cellula ospite
Recettore ACE2, questo test è progettato per imitare l'interazione neutralizzante del virus.
Calibratori, controlli di qualità e campioni di siero o plasma sono ben miscelati bene in diluizione
tampone contenente HACE2-HRP coniugato aliquotato in piccoli tubi. Quindi le miscele vengono trasferite in
I pozzi di micropiastre contenenti frammenti RBD SARS-CoV-2 ricombinanti immobilizzati (RBD) per
incubazione. Durante l'incubazione di 30 minuti, l'anticorpo specifico per l'RBD nei calibratori, QC e
I campioni gareggeranno con HACE2-HRP per legame specifico dell'RBD immobilizzato nei pozzi. Dopo
L'incubazione, i pozzi vengono lavati 4 volte per rimuovere il coniugato HACE2-HRP non legato. Una soluzione di
TMB viene quindi aggiunto e incubato per 20 minuti a temperatura ambiente, con conseguente sviluppo di a
colore blu. Lo sviluppo del colore viene interrotto con l'aggiunta di 1n HCl e l'assorbanza è
misurato spettrofotometricamente a 450 nm. L'intensità del colore formata è proporzionale a
Importo dell'enzima presente ed è inversamente correlato alla quantità di standard analizzati allo stesso modo.
Attraverso il confronto con la curva di calibrazione formata dai calibratori forniti, la concentrazione di
Viene quindi calcolato gli anticorpi neutralizzanti nel campione sconosciuto.
【Materiali richiesti ma non forniti】
1. Acqua distillata o deionizzata
2. Pipette di precisione: 10μL, 100μL, 200μL e 1 ml
3. Suggerimenti per pipette usa e getta
4. Lettore di micropiastre in grado di leggere l'assorbanza a 450 nm.
5. Carta assorbente
6. Carta grafica
7. Mixer vortice o equivalente
【Raccolta e conservazione dei campioni】
1. I campioni di siero e plasma raccolti in tubi contenenti K2-EDTA possono essere utilizzati per questo kit.
2. I campioni devono essere limitati e possono essere conservati per un massimo di 48 ore a 2 ° C - 8 ° C prima del dosaggio.
Gli esemplari detenuti per un tempo più lungo (fino a 6 mesi) devono essere congelati solo una volta a -20 ° C prima del dosaggio.
Evita ripetute cicli di congelamento-scongelamento.
PROTOCOLLO
【Preparazione del reagente】
1. Tutti i reagenti devono essere eliminati dalla refrigerazione e lasciati tornare a temperatura ambiente prima dell'uso
(Da 20 ° a 25 ° C). Salva tutti i reagenti in frigorifero prontamente dopo l'uso.
2. Tutti i campioni e i controlli devono essere vortici prima dell'uso.
3. Preparazione della soluzione HACE2-HRP: concentrato di diluizione HACE2-HRP con un rapporto di diluizione 1: 51 con diluizione
Respingente. Ad esempio, diluire 100 μl di concentrato HACE2-HRP con 5,0 ml di tampone di diluizione HRP a
Crea una soluzione HACE2-HRP.
4. 1 × Wash Solution Preparazione: diluire la soluzione 20 × Wash con acqua deionizzata o distillata con a
Rapporto di volume di 1:19. Ad esempio, diluire 20 ml di soluzione di lavaggio 20 × con 380 ml di deionizzato o
acqua distillata per creare 400 ml di 1 × soluzione di lavaggio.
【Procedura di prova】
1. In tubi separati, aliquota 120 μL della soluzione HACE2-HRP preparata.
2. Aggiungi 6 μL di calibratori, campioni sconosciuti, controlli di qualità in ciascun tubo e mescola bene.
3. Trasferisci 100 μL di ciascuna miscela preparata nella fase 2 nei pozzi di micropiastra corrispondenti secondo
alla configurazione del test predefinita.
3. Coprire la piastra con sigillante per piastra e incubare a 37 ° C per 30 minuti.
4. Rimuovere il sigillante per piastra e lavare la piastra con circa 300 μL di 1 × soluzione di lavaggio per pozzo per quattro volte.
5. Tocca la piastra sul tovagliolo di carta per rimuovere il liquido residuo nei pozzi dopo il lavaggio dei gradini.
6. Aggiungere 100 μL di soluzione TMB a ciascun pozzetto e incubare la piastra al buio a 20-25 ° C per 20 minuti.
7. Aggiungi 50 μL di soluzione di arresto a ciascun pozzetto per fermare la reazione.
8. Leggi l'assorbanza nel lettore di micropiastre a 450 nm entro 10 minuti (630 nm come accessorio
raccomandato per prestazioni di precisione più elevate).