Κιτ ανίχνευσης αντισώματος SARS-COV-2 (ELISA)
【ΑΡΧΗ】
Το κιτ ανίχνευσης αντισώματος SARS-COV-2 βασίζεται στη μεθοδολογία ανταγωνιστικής ELISA.
Χρησιμοποιώντας καθαρισμένη περιοχή δέσμευσης υποδοχέα (RBD), πρωτεΐνη από την πρωτεΐνη ιογενών ακίδων και το κύτταρο ξενιστή
Ο υποδοχέας ACE2, αυτή η δοκιμή έχει σχεδιαστεί για να μιμείται την αλληλεπίδραση εξουδετέρωσης του ιού-ξενιστή.
Οι βαθμονομητές, οι ποιοτικοί έλεγχοι και τα δείγματα ορού ή πλάσματος αναμειγνύονται μεμονωμένα σε αραίωση
Buffer που περιέχει συζευγμένο με HACE2-HRP καμαρίνι σε μικρούς σωλήνες. Τότε τα μείγματα μεταφέρονται
Τα φρεάτια μικροπλάνων που περιέχουν ακινητοποιημένο ανασυνδυασμένο θραύσμα SARS-COV-2 RBD (RBD) για
επώαση. Κατά τη διάρκεια της επώασης των 30 λεπτών, το ειδικό αντίσωμα RBD στους βαθμονομητές, QC και
Τα δείγματα θα ανταγωνίζονται με το HACE2-HRP για συγκεκριμένη δέσμευση του RBD ακινητοποιημένου στα πηγάδια. Μετά
Η επώαση, τα φρεάτια πλένονται 4 φορές για να αφαιρέσουν το Unbound HACE2-HRP συζεύγματος. Μια λύση
Στη συνέχεια, το TMB προστίθεται και επωάζεται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη ενός
μπλε χρώμα. Η ανάπτυξη χρώματος σταματά με την προσθήκη 1n HCl και η απορρόφηση είναι
μετρούμενη φασματοφωτομετρικά στα 450 nm. Η ένταση του σχηματισμού χρώματος είναι ανάλογη προς το
ποσότητα ενζύμου που υπάρχει και αντιστρόφως σχετίζεται με την ποσότητα των προτύπων που αναλύονται με τον ίδιο τρόπο.
Μέσω σύγκρισης με την καμπύλη βαθμονόμησης που σχηματίζεται από τους παρεχόμενους βαθμονομητές, η συγκέντρωση του
Στη συνέχεια υπολογίζονται τα εξουδετερωτικά αντισώματα στο άγνωστο δείγμα.
【Απαιτούνται υλικά αλλά δεν παρέχονται】
1. Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό
2. Πιπέτες ακριβείας: 10μL, 100 μΐ, 200 μΐ και 1 mL
3. Συμβουλές μίας χρήσης πιπέτας
4.
5. Απορροφητικό χαρτί
6. Γραφείο χαρτιού
7. Αναμικτήρα στροβιλισμού ή ισοδύναμο
【Συλλογή και αποθήκευση δειγμάτων】
1. Τα δείγματα ορού και πλάσματος που συλλέγονται σε σωλήνες που περιέχουν K2-EDTA μπορούν να χρησιμοποιηθούν για αυτό το κιτ.
2. Τα δείγματα θα πρέπει να καλύπτονται και να αποθηκεύονται για έως και 48 ώρες στους 2 ° C - 8 ° C πριν από την προσδιορισμό.
Τα δείγματα που διατηρούνται για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (έως 6 μήνες) πρέπει να καταψυχθούν μόνο μία φορά στους -20 ° C πριν από τον προσδιορισμό.
Αποφύγετε τους επαναλαμβανόμενους κύκλους ψύξης-απόψυξης.
ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ
【Παρασκευή αντιδραστηρίου】
1. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αφαιρεθούν από την ψύξη και να επιτρέπεται να επιστρέψει σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση
(20 ° έως 25 ° C). Αποθηκεύστε όλα τα αντιδραστήρια στο ψυγείο αμέσως μετά τη χρήση.
2. Όλα τα δείγματα και τα στοιχεία ελέγχου θα πρέπει να στροβιλίζονται πριν από τη χρήση.
3. Παρασκευή διαλύματος HACE2-HRP: Αραιώστε το συμπύκνωμα HACE2-HRP σε αναλογία αραίωσης 1: 51 με αραίωση
Ρυθμιστής. Για παράδειγμα, αραιώστε 100 μΐ συμπυκνώματος HACE2-HRP με 5.0ml ρυθμιστικού διαλύματος αραίωσης HRP προς
Κάντε μια λύση HACE2-HRP.
4. 1 × Παρασκευή διαλύματος πλυσίματος: αραιώστε το διάλυμα 20 × πλυσίματος με απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό με ένα
Αναλογία όγκου 1:19. Για παράδειγμα, αραιώστε 20 ml διάλυμα 20 χ πλυσίματος με 380 mL απιονισμένου ή
αποσταγμένο νερό για να κατασκευαστεί 400 ml διαλύματος 1 × πλυσίματος.
【Διαδικασία δοκιμής】
1 σε ξεχωριστούς σωλήνες, δείγμα 120μL του παρασκευασμένου διαλύματος HACE2-HRP.
2. Προσθέστε 6 μΐ βαθμονομητών, άγνωστα δείγματα, ποιοτικούς ελέγχους σε κάθε σωλήνα και ανακατέψτε καλά.
3. Μεταφορά 100μL κάθε μίγματος που παρασκευάστηκε στο βήμα 2 σε αντίστοιχα φρεάτια μικροπλάνων σύμφωνα με
σε προκαθορισμένη διαμόρφωση δοκιμής.
3. Καλύψτε την πλάκα με στεγανοποιητή πλάκας και επωάστε στους 37 ° C για 30 λεπτά.
4. Αφαιρέστε το στεγανοποιητικό πλάκας και πλύνετε την πλάκα με περίπου 300 μΐ διαλύματος 1χ πλύσης ανά φρεάτιο τέσσερις φορές.
5. Πατήστε την πλάκα σε χαρτοπετσέτα για να αφαιρέσετε το υπολειμματικό υγρό στα πηγάδια μετά το πλύσιμο.
6. Προσθέστε 100 μΐ διαλύματος TMB σε κάθε φρεάτιο και επωάστε την πλάκα σε σκοτάδι στους 20 - 25 ° C για 20 λεπτά.
7. Προσθέστε 50 μΐ διαλύματος στάσης σε κάθε φρεάτιο για να σταματήσετε την αντίδραση.
8. Διαβάστε την απορρόφηση στον αναγνώστη μικροπλακών στα 450 nm εντός 10 λεπτών (630nm ως αξεσουάρ είναι
συνιστάται για υψηλότερη απόδοση ακριβείας).