SARS-COV-2 Zestaw wykrywania przeciwciał (ELISA)
【ZASADA】
Zestaw neutralizujący przeciwciała SARS-COV-2 oparty jest na konkurencyjnej metodologii ELISA.
Stosując oczyszczoną domenę wiążącą receptor (RBD), białko z białka wirusowego kolca i komórki gospodarza
Receptor ACE2, ten test ma naśladować interakcję neutralizującą wirusa-gospodarza.
Kalibratory, kontrole jakości oraz próbki surowicy lub plazmy są osobno mieszane w rozcieńczeniu
Bufor zawierający koniugat HACE2-HRP śliczono w małych rurkach. Wówczas mieszaniny są przenoszone w
Stuki mikropłytkowe zawierające unieruchomione rekombinowane fragment SARS-COV-2 RBD (RBD) dla
inkubacja. Podczas 30-minutowej inkubacji przeciwciało specyficzne dla RBD w kalibratorach, QC i
Próbki będą konkurować z HACE2-HRP o specyficzne wiązanie RBD unieruchomione w odwiertach. Po
Inkubacja, studzienki są myte 4 razy, aby usunąć nieograniczony koniugat HACE2-HRP. Rozwiązanie
TMB jest następnie dodawany i inkubowany przez 20 minut w temperaturze pokojowej, co powoduje rozwój
niebieski kolor. Rozwój kolorów jest zatrzymany wraz z dodaniem 1N HCl, a absorbancja jest
zmierzone spektrofotometrycznie przy 450 nm. Intensywność utworzonego koloru jest proporcjonalna do
Ilość enzymu obecna i jest odwrotnie związana z ilością standardów oznaczonych w ten sam sposób.
Poprzez porównanie z krzywą kalibracyjną utworzoną przez dostarczone kalibratory, stężenie
Następnie obliczane są przeciwciała neutralizujące w nieznanej próbce.
【Materiały wymagane, ale nie dostarczone】
1. Woda destylowana lub dejonizowana
2. Precyzyjne pipety: 10 μl, 100 μl, 200 μl i 1 ml
3. Dostosowane wskazówki pipety
4. Czytnik mikropłytek zdolny do odczytu absorbancji przy 450 nm.
5. Papier chłonny
6. Papier wykresowy
7. Mikser wiru lub równoważny
【Kolekcja i przechowywanie próbek】
1. Próbki surowicy i plazmy pobrane w rurkach zawierających K2-EDTA można zastosować do tego zestawu.
2. Próbki powinny być ograniczone i mogą być przechowywane do 48 godzin w 2 ° C - 8 ° C przed badaniem.
Próbki utrzymywane przez dłuższy czas (do 6 miesięcy) należy zamrozić tylko raz w temperaturze -20 ° C przed testem.
Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
PROTOKÓŁ
【Przygotowanie odczynników】
1. Wszystkie odczynniki należy wyciągnąć z chłodzenia i pozwolić na powrót do temperatury pokojowej przed użyciem
(20 ° do 25 ° C). Zapisz wszystkie odczynniki w lodówce niezwłocznie po użyciu.
2. Wszystkie próbki i kontrole powinny być wirowane przed użyciem.
3. HACE2-HRP Preparat roztworu: rozcieńczony koncentrat HACE2-HRP przy stosunku rozcieńczenia 1: 51 z rozcieńczeniem
Bufor. Na przykład rozcieńcz 100 μl koncentratu HACE2-HRP z 5,0 ml buforu rozcieńczenia HRP do
Zrób rozwiązanie HACE2-HRP.
4. 1 × PRZEWÓD ROZWIĄZYKA PRZEKOŁANIE: Rozcieńcz roztwór 20 × przemywanie dejonizowaną lub destylowaną wodą za pomocą
Współczynnik objętości 1:19. Na przykład rozcieńczyć 20 ml roztworu 20 × mycie z 380 ml dejonizowanego lub
Woda destylowana do wykonania 400 ml roztworu 1 × mycia.
【Procedura testowa】
1. W oddzielnych rurkach Aliquot 120 μl przygotowanego roztworu HACE2-HRP.
2. Dodaj 6 μl kalibratorów, nieznane próbki, kontrole jakości w każdej rurce i dobrze wymieszaj.
3. Przenieś 100 μl każdej mieszaniny przygotowanej w kroku 2 do odpowiednich studni mikropłytkowych zgodnie z
do poprzedniej konfiguracji testu.
3. Przykryj płytkę uszczelnieniem płytki i inkubuj w 37 ° C przez 30 minut.
4. Wyjmij uszczelnienie płyty i umyj płytkę około 300 μl 1 × roztworu przemycia na cztery razy.
5. Stuknij talerz na ręczniku papierowym, aby usunąć resztkowy ciecz w studniach po schodach.
6. Dodaj 100 μl roztworu TMB do każdej studzienki i inkubuj płytkę w ciemności w 20–25 ° C przez 20 minut.
7. Dodaj 50 μl roztworu stop do każdej studni, aby zatrzymać reakcję.
8. Przeczytaj absorbancję w czytniku mikropłytek przy 450 nm w ciągu 10 minut (630 nm, jak akcesorium
Zalecane dla wyższej wydajności precyzyjnej).