SARS-COV-2 neutraliserende teenliggaamopsporingskit (ELISA)
【Beginsel】
Die SARS-COV-2-neutraliserende teenliggaam-opsporingskit is gebaseer op mededingende ELISA-metodologie.
Met behulp van gesuiwerde reseptorbindingsdomein (RBD), proteïen uit die virale spike (s) proteïen en die gasheer sel
RECEPTOR ACE2, is hierdie toets ontwerp om die virus-gasheer neutraliserende interaksie na te boots.
Kalibrators, kwaliteitskontroles en serum- of plasmamonsters word individueel goed gemeng in verwatering
Buffer wat HACE2-HRP bevat, gekonjugeer in klein buise. Dan word die mengsels in
Die mikroplaatputte wat geïmmobiliseerde rekombinante SARS-COV-2 RBD-fragment (RBD) bevat
inkubasie. Tydens die inkubasie van 30 minute het die RBD-spesifieke teenliggaampie in die kalibrators, QC en
Monsters sal met die HACE2-HRP meeding om die RBD in die putte geïmmobiliseer te bind. Nadat
Die inkubasie, die putte word 4 keer gewas om ongebonde HACE2-HRP-konjugaat te verwyder. 'N oplossing van
TMB word dan bygevoeg en 20 minute by kamertemperatuur geïnkubeer, wat lei tot die ontwikkeling van 'n
blou kleur. Die kleurontwikkeling word gestop met die toevoeging van 1N HCl, en die absorbansie is
gemeet spektrofotometries by 450 nm. Die intensiteit van die gevormde kleur is eweredig aan die
hoeveelheid ensiem teenwoordig, en is omgekeerd verwant aan die hoeveelheid standaarde wat op dieselfde manier bepaal word.
Deur vergelyking met die kalibrasiekurwe wat gevorm word deur die meegeleverde kalibrators, die konsentrasie van
Neutraliserende teenliggaampies in die onbekende monster word dan bereken.
【Materiaal benodig, maar nie voorsien nie】
1. gedistilleerde of gedeïoniseerde water
2. Presisiepipette: 10μL, 100μL, 200μL en 1 mL
3. weggooibare pipetwenke
4. Mikroplaatleser wat absorbansie op 450 nm kan lees.
5. Absorberende papier
6. grafiekpapier
7. Vortex -menger of ekwivalent
【Monsterversameling en berging】
1. Serum- en plasmamonsters wat in buise versamel is wat K2-EDTA bevat, kan vir hierdie stel gebruik word.
2. Monsters moet beperk word en kan tot 48 uur by 2 ° C - 8 ° C gestoor word voordat dit ondersoek word.
Monsters wat langer gehou word (tot 6 maande) moet slegs een keer by -20 ° C voor die toets gevries word.
Vermy herhaalde vries-ontdooi-siklusse.
Protokol
【Reagensvoorbereiding】
1. Alle reagense moet uit die verkoeling geneem word en toegelaat word om terug te keer na kamertemperatuur voor gebruik
(20 ° tot 25 ° C). Stoor alle reagense in die yskas onmiddellik na gebruik.
2. Alle monsters en kontroles moet voor gebruik omgewerk word.
3. HACE2-HRP Oplossing Voorbereiding: Verdun HACE2-HRP-konsentraat by 1: 51 Verdunningsverhouding met verdunning
Buffer. Verdun byvoorbeeld 100 μl HACE2-HRP-konsentraat met 5,0 ml HRP-verdunningsbuffer tot
Maak 'n HACE2-HRP-oplossing.
4. 1 × wasoplossing Voorbereiding: verdun die 20 × wasoplossing met gedeïoniseerde of gedistilleerde water met 'n
volume verhouding van 1:19. Verdun byvoorbeeld 20 ml 20 × wasoplossing met 380 ml gedeïoniseerde of
gedistilleerde water om 400 ml 1 × wasoplossing te maak.
【Toetsprosedure】
1. In aparte buise, aliquot 120μL van die voorbereide HACE2-HRP-oplossing.
2. Voeg 6 μl kalibrators, onbekende monsters, kwaliteitskontroles in elke buis by en meng goed.
3. Oordrag 100μL van elke mengsel wat in die stap 2 berei is in ooreenstemmende mikroplaatputte volgens
na vooraf -ontwerpte toetskonfigurasie.
3. Bedek die plaat met die plaatseëlaar en inkubeer 30 minute by 37 ° C.
4. Verwyder die plaatseëlaar en was die plaat met ongeveer 300 μl 1 × wasoplossing per goed vir vier keer.
5. Tik die plaat op die papierhanddoek om die residuele vloeistof in die putte te verwyder na wasstappe.
6. Voeg 100 μl TMB -oplossing by elke put en inkubeer die plaat in donker by 20 - 25 ° C vir 20 minute.
7. Voeg 50 μl stopoplossing by elke put om die reaksie te stop.
8. Lees die absorbansie in mikroplaatleser binne 10 minute op 450 nm (630 nm soos bykomstigheid is
aanbeveel vir hoër presisieprestasie).